張業(yè)奇，鄧鯤華，楊 怡，王玉婷，王 詩(shī)，丁 虹*

1武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072;2 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100

乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹(Boswellia carterii Birdw)及同屬其它數(shù)種植物皮部切傷后滲出的油膠樹脂。中藥乳香基源植物是乳香樹，產(chǎn)自索馬里和埃塞俄比亞。乳香于《名醫(yī)別錄》、《本草拾遺》和《本草綱目》均有記載并沿用至今，認(rèn)為其辛散溫通，具有活血行氣等功效，廣泛用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的治療［1］。乳香的主要有效成分有揮發(fā)油，其中含有醋酸辛酯和芳樟醇等物質(zhì)，天然的芳樟醇?xì)馕都冋?、圓和，甜潤(rùn)、幽雅，具有安神鎮(zhèn)靜的作用［2］。有文獻(xiàn)表明，乳香精油(Frankincense)芳香療法和灸法綜合應(yīng)用于治療抑郁癥(Depression)的臨床療效同鹽酸氟西汀相近［3］。但是單一使用乳香精油治療抑郁癥尚未見報(bào)道，并且其抗抑郁的機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察單一使用乳香精油對(duì)慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁小鼠行為學(xué)及大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的影響，探究乳香精油抗抑郁的作用并初步探究其抗抑郁機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑

鹽酸氟西汀(批號(hào)2079A，禮來蘇州制藥有限公司)，純?nèi)橄憔?江西億森源香料有限公司，水蒸氣蒸餾法萃取)，5-HT 標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma 公司)，鹽酸、乙酸鈉等其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

搖床，烘箱(上海申光儀器表有限公司)，小鼠行為觀察敞箱，1/100 秒表，HPLC-ECD(日本島津LC-10Avp plus)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2 方法

1.2.1 抑郁模型造模及給藥

參照文獻(xiàn)方法［4］，采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS):將小鼠予以?shī)A尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、45 ℃熱烘(5 min)、晝夜顛倒(24 h)、4 ℃冰水游泳(5 min)、水平振蕩(30 min)等方法隨機(jī)刺激21 d，除空白組外其它組每日給予1 種刺激。小鼠隨機(jī)分為5 組，每組12 只，分別為:空白組、模型組、氟西汀(2 mg/kg)組、低劑量(0.1 mL/100 g)乳香精油組，高劑量(0.2 mL/100 g)乳香精油組。每組按小鼠體重1 mL/100 g 進(jìn)行灌胃(其中乳香精油組以豆油稀釋后灌胃)，空白組及模型組灌服等量生理鹽水，造模同時(shí)即開始給藥，每日1 次，連續(xù)21 d。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行三次，分別在實(shí)驗(yàn)第7 d、實(shí)驗(yàn)第14 d 和實(shí)驗(yàn)第21 d 進(jìn)行。

1.2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

末次給藥60 min 后進(jìn)行，敞箱高40 cm，長(zhǎng)和寬均為100 cm，敞箱底面劃分為面積相等的25 塊方格。小鼠放入敞箱中央1 min 后再記錄小鼠5 min內(nèi)的行為學(xué)表現(xiàn)包括其水平方向移動(dòng)格數(shù)和垂直方向直立(兩前肢離地1 cm 以上)次數(shù)［5］。

1.2.2.2 懸尾實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)完成60 min 后，在距尾尖1 cm 處固定小鼠尾端，使其呈倒掛懸空狀，頭部離箱底5 cm，四周以板隔離小鼠視線。記錄小鼠6 min 內(nèi)后5 min 的懸尾不動(dòng)時(shí)間［6］。

1.2.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

懸尾實(shí)驗(yàn)完成60 min 后，將小鼠頭部朝下放入直徑16 cm、水深18 cm 的游泳杯中，水溫20±2 ℃，記錄小鼠6 min 內(nèi)后5 min 的游泳不動(dòng)時(shí)間［6］。

1.2.3 腦組織勻漿樣本制備及5-HT 的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第22 d，解剖小鼠，將剪取的大腦置于液氮中速凍待測(cè)。從液氮中取出大腦稱重，根據(jù)大腦重量，加入其重量4 倍數(shù)值體積的0.1 M 過氯酸(含0.3 M EDTA 和0.5 mM 亞硫酸鈉)，于冰浴下用勻漿機(jī)快速勻漿。在4 ℃下14000 rpm 離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 針頭過濾器過濾［7］。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器系統(tǒng)(HPLC-ECD)進(jìn)行測(cè)定，色譜條件為:色譜柱為4 mm ×250 mm，Novapak C18，5 μm(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供);流動(dòng)相為15 mM 鹽酸-乙酸鈉緩沖液，pH 4.0(內(nèi)含0.5%三乙胺和0.5 mM EDTA 二鈉)，流速0.6 mL/min。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)第7、14d，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)均顯著增加(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)第21 d，這三組小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)明顯增加，分別增加了157.5%、108.0%、177.4%。

表1 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)的影響(，n=12)Table 1 Effect of frankincense on the frequency of horizontal movement in open-field test (，n=12)

表1 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)的影響(，n=12)Table 1 Effect of frankincense on the frequency of horizontal movement in open-field test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01.

2.2 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響

與空白組比較，第7、14 d 模型組小鼠垂直方向豎直次數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，第7、14 d 氟西汀組、低劑量乳香精油組、高劑量乳香精油組小鼠垂直方向豎直次數(shù)均顯著提高(P＜0.05)。

2.3 乳香精油對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響

與空白組比較，模型組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P＜0.05)。與模型組比較，第7、14 d 氟西汀、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均顯著減少(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)第21 d，這三組小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間分別縮短了67.8%、65.1%、62.8%。

表2 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響(，n=12)Table 2 Effect of frankincense on the frequency of vertical movement in open-field test (，n=12)

表2 乳香精油對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響(，n=12)Table 2 Effect of frankincense on the frequency of vertical movement in open-field test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05.

表3 乳香精油對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響(，n=12)Table 3 Effect of frankincense on the time of tail suspending test (，n=12)

表3 乳香精油對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響(，n=12)Table 3 Effect of frankincense on the time of tail suspending test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05.

表4 乳香精油對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(，n=12)Table 4 Effect of frankincense on the time of forced swimming test (，n=12)

表4 乳香精油對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(，n=12)Table 4 Effect of frankincense on the time of forced swimming test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01.

2.4 乳香精油對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

與空白組比較，模型組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P＜0.05)。與模型組比較，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)第21 d，這三組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間分別縮短了99.2%、36.5%、24.9%。

2.5 乳香精油對(duì)小鼠大腦內(nèi)5-HT 的影響

與空白組比較，模型組小鼠大腦內(nèi)5-HT 含量顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠大腦內(nèi)5-HT 含量均顯著升高(P＜0.05)，分別升高了81.4%、52.7%、37.2%。

表5 乳香精油對(duì)慢性應(yīng)激模型小鼠腦內(nèi)5-HT 的影響(，n=12，ng/g)Table 5 Effect of frankincense on the contents of 5-HT in brain of CUMS model mice (，n=12，ng/g)

表5 乳香精油對(duì)慢性應(yīng)激模型小鼠腦內(nèi)5-HT 的影響(，n=12，ng/g)Table 5 Effect of frankincense on the contents of 5-HT in brain of CUMS model mice (，n=12，ng/g)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，ΔΔP＜0.01.

3 討論

本研究運(yùn)用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激方法，建立經(jīng)典小鼠抑郁癥模型，經(jīng)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠明顯出現(xiàn)抑郁癥狀，證實(shí)該模型建立成功。與模型組比較，氟西汀組和低劑量乳香精油組小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中均有明顯的行為改善(P＜0.05)，高劑量乳香精油組小鼠也有一定的行為改善，證明單一使用乳香精油也能起到一定的抗抑郁作用。

在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究中，腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)，如5-HT、去甲腎上腺素和多巴胺等功能不足的發(fā)病機(jī)制，早已得到普遍公認(rèn)［8］。但是，對(duì)于精油類天然產(chǎn)物如乳香精油的抗抑郁作用機(jī)制并無定論。本實(shí)驗(yàn)中，氟西汀組和乳香精油組小鼠均有不同程度的行為改善，并且在化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)方面，小鼠大腦內(nèi)的5-HT 含量均明顯升高(P＜0.05)，表明乳香精油對(duì)大腦內(nèi)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，揭示了乳香精油抗抑郁作用的一種重要機(jī)制。

乳香精油作為藥食兩用的天然產(chǎn)物，又具有良好的抗抑郁作用。本實(shí)驗(yàn)探索了精油灌胃的給藥方式，為乳香精油類抗抑郁保健品或藥品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，有望降低現(xiàn)行抗抑郁藥物如氟西汀等對(duì)肝和腎的毒副作用。

1 Chang YP(常允平)，Han YM(韓英梅)，Zhang JY(張俊艷).Research advance on chemical constituents and pharmacological action of Boswellia carterii.Drugs Clin (現(xiàn)代藥物與臨床)，2012，1(27):52-59.

2 Liu HL(劉洪玲).GC-MS of essential oil in Frankincense.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2009，20:370-371.

3 Liu Y(劉瑤)，Qiao Y(喬瑜)，Li L(李玲)，et al.Aromatherapy with moxibustion treatment of depression in clinical research.Pract Tradit Chin Med(實(shí)用中醫(yī)藥雜志)，2009，25:213-214.

4 Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant.Phychopharm，1987，93:358-364.

5 Kennett GA，Dickinson SL，Curzon G.Enhancement of some 5-HT-dependent behavioural responses following repeated immobilization in rats.Brain Res，1985，330:253-263.

6 Xiong JY(熊靜悅)，Zeng N(曾南)，Zhang CY(張崇燕)，et al.Antidepressant effect of Xiaoyaosan.Pharmocol Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2007，23:3-5.

7 Tang YM(唐亞梅)，Chen CM(陳春梅)，Liu Y(劉勇).Concentration change of DA，5-HT and their metabolites in brain tissue of depression models rat treated with chronic unpredicted mild stress.Hunan Normal Univ，Med Sci(湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2012，9(3):57-64.

8 Racagni G，Brunello N.Physiology to functionality:The brain and neurotransmitter activity.Int Clin Psychopharmacol，1999，14:3-7.