高紅琴(山西康寶生物制品股份有限公司，長(zhǎng)治 046000)

人凝血因子Ⅷ是由健康人血漿蛋白經(jīng)過分離、提純獲得的血液制品，是內(nèi)源性凝血途徑中的關(guān)鍵性凝血因子，臨床上主要用于甲型血友病的治療，也用于平時(shí)的臨床使用中，如在大出血或大手術(shù)時(shí)輸注給患者可以補(bǔ)充或提高血漿Ⅷ水平，以保持正常的凝血功能［1］。

在人凝血因子Ⅷ生產(chǎn)過程中，采用氫氧化鋁凝膠吸附去除凝血酶原復(fù)合物和部分變性的纖維蛋白原，收集離心上清液，并經(jīng)S/D病毒滅活、超濾濃縮、透析、離子交換層析(Q-sepharoes FF)純化、冷凍干燥、干熱滅活病毒等步驟。雖然經(jīng)離心和離子交換層析等步驟可去除掉氫氧化鋁，但成品中有可能殘存微量的氫氧化鋁。人體攝入過多的鋁將直接破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸的功能，不僅使人易患老年癡呆，還會(huì)引發(fā)腎功能損傷［2］。因此為保證制劑對(duì)人體的安全，應(yīng)建立準(zhǔn)確有效的測(cè)定人凝血因子Ⅷ中鋁殘留量的方法。經(jīng)過查找相關(guān)資料，人凝血因子Ⅷ中鋁殘留量測(cè)定方法未見報(bào)道。我們參考《中國(guó)藥典》［3］2010年版三部附錄ⅦK“人血白蛋白鋁殘留量測(cè)定法”和相關(guān)文獻(xiàn)［4］建立了人凝血因子Ⅷ中鋁殘留量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 儀器與試劑

1．1 儀器

AA-6300C原子吸收分光光度計(jì)(日本島津);鋁空心陰極燈(日本島津);AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1．2 試劑

硝酸(aladdin chemistry，批號(hào):11306011);鋁元素(1 000 μg/ml，唯一標(biāo)識(shí):14357-2，定值日期:2014年3月。國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心);純化水(山西康寶生物制品股份有限公司);人凝血因子Ⅷ樣品批號(hào):20140601(山西康寶生物制品股份有限公司)。

2 結(jié)果

2．1 人凝血因子Ⅷ鋁殘留量測(cè)定方法

2．1．1 儀器條件 參考相關(guān)文獻(xiàn)［5］設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)309．3 nm;狹縫寬 0．7 nm;燈電流 10 mA;進(jìn)樣量 10 μl;石墨爐升溫程序見表1。

2．1．2 測(cè)定方法 樣品處理:取人凝血因子Ⅷ樣品(批號(hào):20140601)，平衡至25-37℃，加入25-37℃滅菌注射用水10 ml，輕輕搖動(dòng)至完全溶解。

0．15 mol/L硝酸溶液的制備:精密量取濃度為63．01% 的硝酸 9．38 ml，用純化水定容至 1 000 ml，搖勻即得。

100 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液的制備:精密量取100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液0．1 ml置于100 ml容量瓶中，用0．15 mol/L硝酸溶液稀釋至刻度。

表1 石墨爐升溫程序Table 1 Graphite furnace temperature program

按表2分別制備空白對(duì)照溶液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液，按2．1．1項(xiàng)設(shè)定原子吸收分光光度計(jì)條件，精密量取空白對(duì)照溶液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液各10 μl，分別注入儀器，讀數(shù)，按下式計(jì)算:

公式中，B為空白對(duì)照溶液讀數(shù);S0為供試品溶液讀數(shù);S為標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液讀數(shù);20為標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液中標(biāo)準(zhǔn)鋁的含量:12．5為供試品稀釋倍數(shù)。

表2 空白對(duì)照、供試品及混合溶液的制備Table 2 Preparation of blank control，test solution and mixed solution

2．2 方法學(xué)研究

2．2．1 檢測(cè)限度 取試劑空白溶液(0．15 mol/L HNO3溶液)連續(xù)測(cè)量10次，記錄吸光度值分別為0．086 5，0．079 2，0．084 4，0．086 8，0．083 9，0．087 1，0．081 6，0．083 2，0．079 5，0．082 4，平均值為 0．083 5，吸光度的SD值為0．002 71。

再取標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液(100 ng/ml)適量，用 0．15 mol/L HNO3溶液分別稀釋成濃度為 50．0，20．0，10．0，5．0，2．0，1．0 μg/L 的鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測(cè)定吸光度值分別為 0．549 6，0．217 4，0．104 4，0．062 3，0．041 6，0．025 3，當(dāng)鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 1．0 μg/L時(shí)，吸光度值(0．025 3)和空白溶液10次吸光度值的10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(0．027 1)接近，所以檢測(cè)限度為1．0 μg/L。

2．2．2 線性關(guān)系及線性范圍考察 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液(100 ng/ml)適量，用0．15 mol/L HNO3溶液稀釋制成鋁含量為 2．0，5．0，10．0，20．0，30．0 μg/L的溶液，按上述測(cè)試條件進(jìn)樣，記錄吸光度值。以每一濃度3次吸光度讀數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，回歸計(jì)算?；貧w方程:A=0．010 2C+0．015 3，R2=0．997 3。式中:A 為吸光度值;C 為鋁濃度，單位為μg/L。鋁濃度對(duì)吸光度的線性關(guān)系結(jié)果結(jié)果表明:鋁含量在2．0-30．0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見表3，圖1)。

表3 鋁濃度對(duì)吸光度線性關(guān)系結(jié)果Table 3 Relationship between concentration of aluminum and absorbance

圖1 鋁濃度對(duì)吸光度線性關(guān)系Figure 1 Relationship between concentration of aluminum and absorbance

2．2．3 精密度試驗(yàn) 精密量取標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液(100 ng/ml)適量，用0．15 mol/L HNO3溶液配制成鋁含量為20．0 μg/L的溶液，按上述測(cè)試條件，連續(xù)進(jìn)樣10次，測(cè)定吸光度，記錄吸光度值分別為0．197 8，0．201 2，0．201 4，0．193 7，0．199 1，0．204 3，0．201 1，0．198 3，0．192 7，0．195 9，平均值為 0．198 9，吸光度的RSD值為1．84%，符合測(cè)定要求，表明實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2．2．4 重復(fù)性試驗(yàn) 取人凝血因子Ⅷ樣品，配制6份供試品溶液，按照上述儀器條件進(jìn)樣，計(jì)算鋁殘留量測(cè)定結(jié)果分別為 61．7，58．4，53．8，52．1，52．1，59．8 μg/L，平均鋁殘留量為 56．3 μg/L，6 份供試品溶液的RSD值為7．48%，說明該方法重復(fù)性較好。

2．2．5 回收率試驗(yàn) 取人凝血因子Ⅷ樣品(批號(hào):20140601，重復(fù)性試驗(yàn)平均鋁殘留量為56．3 μg/L)，平衡至25-37℃，按標(biāo)示量加入25-37℃滅菌注射用水10 ml，輕輕搖動(dòng)至完全溶解。

按表4配制標(biāo)準(zhǔn)鋁加入量分別為15．0，20．0，25．0 ng/ml的樣品各 3 份，每份進(jìn)樣 10 μl。按鋁殘留量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)3次吸光度，用平均值計(jì)算鋁測(cè)得總量，然后計(jì)算回收率。樣品回收率測(cè)定結(jié)果顯示，鋁含量平均回收率97．4%，RSD為2．11%(見表5)。結(jié)果表明:該方法具有良好的回收率。

表4 樣品制備Table 4 The sample preparation

表5 回收率測(cè)定結(jié)果 (n=9)Table 5 Results of recovery test (n=9)

3 討論

采用原子吸收分光光度法測(cè)定血液制品中鋁殘留量國(guó)內(nèi)已有報(bào)道［4］，并且中國(guó)藥典也是采用該方法檢測(cè)人血白蛋白中鋁殘留量。該方法屬于痕量法，測(cè)定過程中易于受到干擾，主要影響因素有兩方面，一是玻璃中含有Al2O3，在pH值較低時(shí)，鋁離子更易溶出，造成污染，所以試驗(yàn)中盡量使用惰性塑料器皿;二是因鋁大量存在于空氣顆粒中，因此所有器皿洗凈后應(yīng)保存在潔凈的密閉盒中，盡量用小口器皿，試驗(yàn)中隨時(shí)蓋緊。該原子吸收分光光度法與分光光度比色法相比，具有明顯的靈敏度高，操作過程簡(jiǎn)便、快速［6］，并且該方法準(zhǔn)確度好，精密度高，完全能夠滿足人凝血因子Ⅷ中鋁殘留量的測(cè)定。

［1］鄧靖，尹惠瓊，胡吉軍，等．干熱法對(duì)人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒滅活效果驗(yàn)證［J］．中國(guó)輸血雜志，2014，27(2):168-171．

［2］蔣煒，唐洪，李春華，等．塞曼-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定膨化食品中的鋁［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(1):85-86．

［3］國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典三部［S］．2010年版．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅦK．

［4］肖林，程雅琴．檢測(cè)人血白蛋白中鋁含量的石墨爐原子吸收分光光度法的建立［J］．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2001，14(3):178-180．

［5］高紅琴，付強(qiáng)．磺基水楊酸沉淀蛋白法測(cè)定人血白蛋白鋁含量［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45(12):1163-1165．

［6］李秀娟，王麗，劉召金，等．食品中鋁含量測(cè)定的研究進(jìn)展［J］．廣東化工，2012，39(14):76-77．