劉桂花， 邢建國(guó)， 王云飛， 帕依曼·亥米提， 何承輝

（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方必清顆粒中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元

劉桂花， 邢建國(guó)， 王云飛， 帕依曼·亥米提， 何承輝*

（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

目的建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方必清顆粒 （菝葜、天山堇菜、秋水仙、訶子肉、白花丹、西青果、玫瑰花）中秋水仙堿，槲皮素及薯蕷皂苷元3種成分的HPLC法。方法復(fù)方必清顆粒80%甲醇提取液的HPLC分析在Cosmosil-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱進(jìn)行，流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.4%磷酸 （B），梯度洗脫，秋水仙堿和槲皮素檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，薯蕷皂苷元為203 nm，體積流量1 mL/min，柱溫為35℃。結(jié)果秋水仙堿在7.62～76.2μg/m L、槲皮素在11.02～77.14μg/mL、薯蕷皂苷元在23.15～231.5μg/mL范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系；相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7，0.999 7，0.999 8；秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的平均回收率分別為99.8% （RSD為1.2%），100.0% （RSD為1.1%）和99.6% （RSD為1.1%）。樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論該方法中秋水仙堿和槲皮素的分離效果較好，峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適中，可作為該顆粒制劑的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；復(fù)方必清顆粒；秋水仙堿；槲皮素；薯蕷皂苷元

復(fù)方必清顆粒處方來源于新疆維吾爾族醫(yī)院，是由菝葜、秋水仙、天山堇菜、訶子肉、地錦草、白花丹、西青果和玫瑰花八味藥材組成的復(fù)方制劑，為維藥經(jīng)典方，具有清血、消炎止痛的功效。用于子宮內(nèi)膜炎，宮頸糜爛，附件炎等婦科疾病。菝葜是方中君藥，近年來，以菝葜為主藥研制了多種復(fù)方治療婦科病，臨床常用于治療各種婦科炎癥，療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：菝葜的總皂苷部位，具有明顯的抗炎效果，并且對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。菝葜乙醇提取物具有抑菌作用，具有拮抗大鼠蛋白清性及角叉菜膠性動(dòng)物足趾腫脹，以及對(duì)二甲苯所致大鼠耳腫脹有明顯的抑制鎮(zhèn)痛作用。菝葜中含有多種皂苷，其中薯蕷皂苷元（diosgenin）為其主要有效成分。秋水仙主要有效成分為秋水仙堿（colchicine），具有解毒散結(jié)、抗炎、消腫止痛的功效，是抗炎鎮(zhèn)痛抗風(fēng)濕的主要活性成分。地錦草具有清熱解毒、利濕退黃、涼血止血的功效，藥理研究證實(shí)其化學(xué)成分中的槲皮素（quercetin）、山柰素等黃酮類化合物是地錦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方必清顆粒中秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元的量，旨在為及時(shí)檢測(cè)并全面跟蹤有效成分在復(fù)方必清顆粒制備過程中各工序的轉(zhuǎn)移率提供一種高效方法，同時(shí)也為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)的理論依據(jù)［1-9］。

1 儀器與材料

LC-20A型高效液相色譜儀 （日本島津制造）：SPD-20A紫外檢測(cè)器、LC-20AB溶劑輸送泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution數(shù)據(jù)工作站，AB135-S梅特勒-托利多電子天平 （瑞士），BS110S型Sartorius電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；JM-B2003電子天平 （余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；WP-UP-IV-10型Water Purifier實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄆城永興儀器廠）。

對(duì)照品槲皮素 （批號(hào)100081-200907）、薯蕷皂苷元 （批號(hào)111539-200001）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，秋水仙堿對(duì)照品 （批號(hào)086K1576）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich（西格瑪）公司。復(fù)方必清顆粒由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制 （批號(hào)：130809、130813、130818）。乙腈購(gòu)自美國(guó)霍尼韋爾（Honeywell B&J）公司，色譜純；甲醇購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Cosmosil-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），按表1進(jìn)行梯度洗脫；雙波長(zhǎng)檢測(cè)，350 nm檢測(cè)秋水仙堿和槲皮素，203 nm檢測(cè)薯蕷皂苷元；體積流量1 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量10μL。運(yùn)行時(shí)間為80 min。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取秋水仙堿對(duì)照品7.62 mg置25 m L量瓶中，槲皮素對(duì)照品5.71 mg、薯蕷皂苷元對(duì)照品4.63 mg分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL分別含秋水仙堿304.8 μg、槲皮素551μg和薯蕷皂苷元463μg的貯備液。分別精密吸取上述貯備液1.5、1.0、2.5 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為45.72、55.1、115.75μg/mL的混合對(duì)照品溶液。將上述對(duì)照品貯備液、混合對(duì)照品溶液于4℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方必清顆粒樣品適量研細(xì)，約1.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲 （功率100 W，頻率40 kHz）處理45 min，取出，放冷，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按復(fù)方必清顆粒的處方，分別稱取不含秋水仙、不含菝葜、不含地錦草的復(fù)方藥材，按 “2.2.2”項(xiàng)下的方法制成相應(yīng)的陰性樣品溶液，4℃冷藏備用。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果，秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元的保留時(shí)間分別為22、32、71 min左右，陰性樣品對(duì)測(cè)定沒有干擾，分離度良好，對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

3.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取秋水仙堿貯備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X與其峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明秋水仙堿在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

精密吸取槲皮素貯備液5mL至25mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，制成質(zhì)量濃度為110.2μg/m L的稀釋液。再精密吸取稀釋液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度與其峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明槲皮素在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

精密吸取薯蕷皂苷元貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 m L棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X與其峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明薯蕷皂苷元在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equations and linear range of reference substances

3.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元峰面積的RSD（n=6）分別為1.2%、0.9%、1.5%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào) （批號(hào)130809）樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備一份供試品溶液，室溫放置，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、6、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元峰面積的RSD（n=6）分別為1.0%、1.2%、1.4%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)130801的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按上述色譜條件測(cè)定。計(jì)算求得秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的平均含有量 （n=6）分別為0.273 8、0.592 8、0.983 9 mg/g，RSD分別為1.5%、1.9%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.75 g已知含有量的復(fù)方必清顆粒樣品 （批號(hào)130809），共9份，平均分為3組，分別按樣品中各成分含有量與相應(yīng)對(duì)照品加入量的比例約為1∶0.8、1∶1、1∶1.2，精密加入秋水仙堿對(duì)照品溶液（0.304 8 mg/mL）0.5、0.7、0.9mL，槲皮素對(duì)照品溶液 （0.181 2 mg/mL）2.0、2.5、3.0 mL，薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液（0.297 6 mg/mL）2.0、2.5、3.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)的結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests

3.7 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的復(fù)方必清顆粒樣品（批號(hào)分別為130809、130813、130818），各3份，按 “2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定3批樣品中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(mg·g-1,n=3)Tab.4 Test results of sam p les(mg·g-1,n=3)

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm［10］、368 nm［11］、254 nm［12］。本實(shí)驗(yàn)于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)秋水仙堿在350 nm和245 nm處有最大吸收，當(dāng)選擇254 nm時(shí)，樣品中秋水仙堿峰的前面有個(gè)小峰的干擾，因樣品中秋水仙堿的峰面積比槲皮素的峰面積小，為減少干擾，提高方法的準(zhǔn)確度，故考慮采用秋水仙堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。且在此波長(zhǎng)下，秋水仙堿和槲皮素的分離效果都很好。查閱文獻(xiàn)可知［13］，薯蕷皂苷元的最大吸收波長(zhǎng)為203 nm。此條件也符合 《中國(guó)藥典》2005年版菝葜項(xiàng)下測(cè)定薯蕷皂苷元的條件。

4.2 梯度洗脫依據(jù) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［13-15］，秋水仙堿和槲皮素多采用甲醇-0.4%磷酸 （50∶50）為流動(dòng)相，出峰時(shí)間均小于30 min，但薯蕷皂苷元在此條件下出峰很晚，在90 min時(shí)還未出峰，《中國(guó)藥典》2005年版菝葜項(xiàng)下測(cè)定薯蕷皂苷元的條件為乙腈-水 （90∶10），因此，選擇梯度洗脫。本實(shí)驗(yàn)嘗試了乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，秋水仙堿和槲皮素峰的拖尾都較嚴(yán)重，分離效果差。采用乙腈-0.4%磷酸系統(tǒng)，在梯度的前段，當(dāng)采用乙腈-0.4%磷酸（25∶75）時(shí)，秋水仙堿和槲皮素的分離效果較好，峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適中。在梯度的后段，當(dāng)選擇乙腈-0.4%磷酸 （90∶10）時(shí)，薯蕷皂苷元的出峰時(shí)間為71 min，分離效果較好。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2005年版一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：216.

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Simultaneous determ ination of colchicine，quercetin and diosgenin in Com pound Biqing Granules by HPLC

LIU Gui-hua， XING Jian-guo， WANG Yun-fei， Payiman-Haimiti， HE Cheng-hui*
（Xinjiang Instituteof Meteria Medica，Urumchi830004，China）

AIMTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of colchicine，quercetin and diosgenin in Compound Biqing Granules（Smilax，Viola tianshanica Maxim，Colchicum autumnale，F(xiàn)uphorbia humifusa，Terminalia chebula，etc.）.METHODSHPLC analysis of 80%methanolic extract from Compound Biqing Granules was performed on Cosmosil column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile（A）-0.4%ortho-phosphoric acid（B）solution in a gradientelutionmode，the detection wavelength was set at 350 nm for colchicine and quercetin as well as 203 nm for diosgenin and flow rate was 1 mL/min.The column temperature wasmaintained at35℃.RESULTSThemethod had good linear relationship within the range of 7.62-76.2μg/mL for colchicine（r=0.999 7），11.02-77.14μg/mL for quercetin（r= 0.999 7），and 23.15-231.5μg/mL for diosgenin（r=0.999 8），respectively.The average recoveries were 99.8%（RSD=1.2%）for colchicine，100.0%（RSD=1.1%）for quercetin，99.6%（RSD=1.1%）for diosgenin，respectively.The sample solution was stable within 24 h.CONCLUSIONThemethod has a good separation effects，symmetrical peak forms，and peak flowing out available，and is recommended as control standard for Compound Biqing Granules.

HPLC；Compound Biqing Granules；colchicine；quercetin；diosgenin

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1487-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.020

2014-10-09

新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng) （201130105-3）

劉桂花 （1984—），女，助理研究員，碩士，從事藥物新制劑與新劑型研究。Tel：（0991）2318172，E-mail：lisena_lgh@ 163.com

*通信作者：何承輝 （1974—），女，副研究員，碩士，從事藥物新制劑與新劑型研究。Tel：（0991）2318172，E-mail：hch301@sohu.com