李桂蘭， 賀智勇， 薛雨晨， 吳林菁， 陶 玲*， 沈祥春*

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院中藥藥劑教研室，貴州貴陽(yáng)550004；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院天然藥物優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550004）

閃式提取法用于大蝎子草總黃酮的工藝條件研究

李桂蘭1，2， 賀智勇1，2， 薛雨晨1，2， 吳林菁1，2， 陶 玲1，2*， 沈祥春1，2*

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院中藥藥劑教研室，貴州貴陽(yáng)550004；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院天然藥物優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550004）

目的探索有效的大蝎子草總黃酮提取方法。方法比較回流提取、閃式提取兩種方法，及水和乙醇分別作為溶劑提取大蝎子草總黃酮的效果，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)閃式提取大蝎子草總黃酮工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果閃式提取大蝎子草總黃酮最佳工藝為蒸餾水溫度60℃，料液比1∶75，提取時(shí)間為4 min，閃提轉(zhuǎn)速4 000 r/min，提取率為9.093 mg/g，優(yōu)于乙醇為溶劑的回流提取法。結(jié)論閃式提取法操作簡(jiǎn)便、高效經(jīng)濟(jì)，與回流提取法相比，采用閃式提取法并用熱水作溶劑提取大蝎子草總黃酮取得較好效果。

大蝎子草；總黃酮；閃式提??；正交試驗(yàn)

大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的全草或根作為貴州苗族民間用藥歷史悠久，在 《貴州中草藥名藥》《滇藥錄》 《藏本草》 《四川常用草藥》等均有記載，味苦、辛，性涼，有小毒，主要用于治療中風(fēng)不語(yǔ)、咳嗽多痰、風(fēng)濕疼痛、跌打損傷、骨折等［1-2］。蕁麻屬植物生態(tài)學(xué)和藥效學(xué)及臨床等方面研究較多，但大蝎子草的提取工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道［3-6］。

閃式提取法是近年發(fā)展起來(lái)的一種用于中草藥提取的高新技術(shù)，該設(shè)備以組織破碎原理為基礎(chǔ)，具有快速、高效、充分、完全提取、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，而且節(jié)省能源，有效保護(hù)了提取物質(zhì)中的熱敏性成分，與傳統(tǒng)提取方法相比具有非常顯著的優(yōu)勢(shì)。

本研究以大蝎子草中抗炎有效成分總黃酮含有量為指標(biāo)，進(jìn)行不同提取方法和不同溶劑對(duì)大蝎子草總黃酮提取率影響的考察，探討并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)閃式提取工藝條件進(jìn)行研究，為大蝎子草中有效成分的提取提供簡(jiǎn)便、快捷的方法。

1 儀器與試藥

JHBE-50S閃式提取控制器 （北京金鼎科技發(fā)展有限公司）；UV2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （島津）；FA20304電子分析天平 （上海恒平科學(xué)儀器有限公司），托盤(pán)天平（上海光正醫(yī)療器械有限公司）；

芹菜素對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度大于98%）；乙醇為分析純。大蝎子草藥材采集于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蕁麻科蝎子草屬植物大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取芹菜素對(duì)照品5 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，即得0.20 mg/mL的芹菜素對(duì)照品貯備液。

2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 以乙醇為空白對(duì)照，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，分別在波長(zhǎng)為190～400 nm區(qū)間掃描芹菜素對(duì)照品和大蝎子草供試樣，結(jié)果表明，二者均在在268 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，故選擇最大吸收波長(zhǎng)為268 nm［7］。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于50 mL量瓶中，乙醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0μg/mL的對(duì)照品供試液。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在268 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y= 0.035 5X+0.001 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。結(jié)果表明芹菜素在2.0～12.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在268 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算得RSD為0.23%，表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，搖勻，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、24 h于268 nm波長(zhǎng)處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，并計(jì)算其前8 h的RSD為8.6%，前6 h的RSD為2.2%，說(shuō)明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取6份1 mL供試溶液置于25 mL量瓶中，分別用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，計(jì)算得到RSD為1.4%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取6份1 mL供試溶液置于25 mL量瓶中，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.200 mg/mL上述對(duì)照品溶液，分別相當(dāng)于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg，定容，搖勻，在268 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均回收率為99.2%，RSD為0.57%。

2.1.8 大蝎子草中總黃酮的定量測(cè)定 取大蝎子草提取液適量，過(guò)濾，3 000 r/min離心10min，精密移取上清液5mL，備用；分別采用石油醚洗脫、乙酸乙酯萃取等多種樣品處理方法進(jìn)行考察，最后采用精密移取離心后的大蝎子草提取液5 mL，置于蒸發(fā)皿中，揮干，60%乙醇洗至25 mL量瓶中，定容；再精密移取1 mL置25 mL量瓶中，95%乙醇定容，于波長(zhǎng)268 nm處測(cè)定吸光度值并計(jì)算總黃酮的含有量。

2.2 大蝎子草總黃酮閃式提?。?-9］

2.2.1 因素水平 選取蒸餾水溫度 （℃），料液比（m/V），提取時(shí)間（min）為考察因素，見(jiàn)表1。

表1 閃式提取工藝因素水平

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 分別稱取大蝎子草細(xì)粉9份，每份20 g，閃提轉(zhuǎn)速4 000 r/min，電壓200 V，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2，測(cè)定提取液中總黃酮含有量，考察最佳提取工藝條件。

表2 閃式提取工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

2.2.3 方差分析 運(yùn)用SPSS軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表3可知，A、B因素對(duì)閃式提取大蝎子草總黃酮含有量的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合直觀分析，各因素影響大小順序?yàn)椋築＞A＞C，即料液比＞蒸餾水溫度＞提取時(shí)間，最佳工藝條件是A2B3C2，即蒸餾水溫度60℃，料液比為1∶75，提取時(shí)間為4 min。

2.2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取大蝎子草細(xì)粉5份，每份20 g，按照最佳工藝進(jìn)行提取，測(cè)定并計(jì)算總黃酮含有量，得到總黃酮平均含有量為9.093 mg/g生藥，RSD為1.7%，見(jiàn)表4。

表4 最佳提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

閃式提取器外刀腔內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)，內(nèi)外刀之間不僅產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切作用，同時(shí)外刀腔內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)大的負(fù)壓，藥材被破碎而充分暴露的物質(zhì)分子 （被提取成分）在負(fù)壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用下被溶劑分子包圍，解離，溶解，替代，脫離，然后迅速進(jìn)入溶劑中，瞬間達(dá)到溶劑濃度的平衡，在數(shù)秒內(nèi)快速完成提取過(guò)程［10］。

本次閃式提取研究中，首先根據(jù)黃酮的理化性質(zhì)，設(shè)置50倍溶劑量，采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行50%、60%、70%乙醇提取大蝎子草總黃酮閃式提取考察，結(jié)果顯示，總黃酮最大提取率僅為3.45mg/g，低于前期水為溶劑回流提取正交試驗(yàn)考察結(jié)果。結(jié)合前期總黃酮測(cè)定方法，采用較優(yōu)的工藝條件，用水和乙醇為溶劑進(jìn)行了回流提取的比較，結(jié)果顯示，對(duì)于大蝎子草總黃酮的提取，水為溶劑比乙醇作為溶劑的效果好，所以閃式提取工藝考察中采用水為溶劑進(jìn)行，同時(shí)還進(jìn)行了蒸餾水不同溫度的考察，結(jié)果表明，當(dāng)蒸餾水溫度為60℃時(shí)提取率比40℃和80℃好，40℃時(shí)優(yōu)于80℃，原因可能是，黃酮類化合物一般都以苷的形式存在，苷易溶于熱水，所以熱水效果優(yōu)于冷水；但由于80℃的溫度過(guò)高，使藥材細(xì)胞表面蛋白迅速固化成膜，外界的水不易進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞不能因滲透壓差破裂，及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散效率變低，總黃酮不能從細(xì)胞內(nèi)高效提取出來(lái)。

本實(shí)驗(yàn)以總黃酮提取率為指標(biāo)，以蒸餾水溫度、料液比、提取時(shí)間作為正交試驗(yàn)的3個(gè)考察因素，并各設(shè)了3個(gè)水平對(duì)大蝎子草的閃式提取工藝進(jìn)行了考察。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，閃式提取大蝎子草總黃酮的最大影響因素是料液比，其次是蒸餾水溫度，最小影響因素是提取時(shí)間。結(jié)合直觀分析，可以確定最佳實(shí)驗(yàn)條件是A2B3C2，即提取溫度為60℃，料液比為1∶75，提取時(shí)間為4min，按該最佳提取工藝進(jìn)行提取時(shí)，大蝎子草總黃酮為9.093 mg/g生藥。

閃式提取法具有快速高效、省時(shí)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能最大限度保護(hù)植物的有效成分不受熱破壞，提取率高，節(jié)約能源［11］。但由于大蝎子草藥材質(zhì)地疏松，回流提取至少都需要接近20倍的溶劑量，采用閃式提取所用溶劑量更是大為提高。

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R284.2

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：1001-1528（2015）07-1603-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.049

2014-08-03

貴州省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目 （黔科合外G字 ［2012］7041）；貴州省中醫(yī)藥管理局課題項(xiàng)目 （QZYY2012-46）；貴州省中醫(yī)藥管理局課題項(xiàng)目 （QZYY2019-92）；貴陽(yáng)市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目 （2012204）；貴陽(yáng)市科技局大學(xué)生創(chuàng)新課題 （黔科合同2012［2］）

李桂蘭 （1965—），女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幮滤幯邪l(fā)。Tel：（0851）6908568，E-mail：1254679469@qq.com

*通信作者：陶 玲 （1975—），女，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0851）6908568（721），E-mail：649511230@qq.com沈祥春（1973—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：（0851）6908568，E-mail：shenxiangchun@126.com