趙俞+余智+盧波達(dá)+劉凱的+方來明

[摘要] 目的 探討急性腦缺血再灌注損傷大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律及吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）干預(yù)對上述指標(biāo)的影響。 方法 將84只SD大鼠隨機(jī)分為PGZ組（n=42）及對照組（n=42），前者通過改良Zea-longa法建立腦缺血再灌注損傷模型后立即經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg的PGZ，對照組則用同等劑量的生理鹽水代替PGZ，以后各組分別每24小時(shí)腹腔注射1次等量PGZ/生理鹽水，直至SD大鼠被處死，并以傷后處死時(shí)間分為7個(gè)亞組，分別為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每個(gè)亞組各6只。取缺血灶周圍組織采用免疫組織化學(xué)方法檢測并比較腦組織中TNF-α及IL-10的蛋白表達(dá)，同時(shí)采用TUNEL法觀察并比較細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 PGZ組TNF-α蛋白表達(dá)量較對照組明顯下降（P<0.05），而IL-10顯著上升（P<0.05），且兩組中二者均呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；同時(shí)PGZ組腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量較對照組也有所下降（P<0.05）。結(jié)論 腦缺血再灌注損傷后，吡格列酮可能通過降低TNF-α的活性上調(diào)IL-10的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，阻止神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步凋亡，從而對缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 吡格列酮；腦缺血再灌注損傷；TNF-α；IL-10；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）35-0001-04

目前在2型糖尿病的治療過程中，吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）在減少外周組織和肝臟的胰島素抵抗、增加依賴胰島素的葡萄糖處理、減少肝糖的輸出方面具有重要意義。研究表明，吡格列酮對腦缺氧缺血、低血糖、創(chuàng)傷和癲癇發(fā)作時(shí)發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用與激活過氧化物酶增殖體激活受體-γ（PPARγ）抑制炎癥等途徑有關(guān)[1]。然而，其具體神經(jīng)保護(hù)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。故本實(shí)驗(yàn)采用PGZ對改良Zea-longa 法建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型大鼠進(jìn)行治療干預(yù)，檢測TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá)及其對細(xì)胞凋亡的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)分子機(jī)制，為該藥用于腦缺血缺氧性疾病的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

選取84只清潔級(jí)雄性SD大鼠[浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033]，體重（265±15）g。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，用隨機(jī)數(shù)字表法分為PGZ組42只、對照組42只，再根據(jù)傷后處死時(shí)間分為7個(gè)亞組，分別為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每個(gè)亞組各6只。

1.2 主要試劑

吡格列酮（PGZ）（美國Sigma公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-10（IL-10）免疫組化試劑盒（美國R&D Systems公司）；TUNEL原位末端標(biāo)記試劑盒（美國Promega公司）；電子顯微鏡（日本OLYMPUS公司）等。

1.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備及處理

灌注。模型成功標(biāo)志[2]：大鼠蘇醒后出現(xiàn)術(shù)側(cè)Horner綜合征；爬行時(shí)跌倒或向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；提尾懸拉后出現(xiàn)缺血灶對側(cè)上肢蜷縮屈曲。PGZ組待大鼠自然蘇醒后立即經(jīng)尾靜脈注射PGZ 10 mg/kg，對照組則經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水，以后各組分別每24小時(shí)經(jīng)尾靜脈注射一次等量PGZ/生理鹽水，直至大鼠被處死。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 TNF-α及IL-10蛋白的表達(dá) 大鼠深度麻醉成功后，開胸暴露并游離出心臟，以生理鹽水灌洗到雙肺色白，后再灌注冰凍（4℃）4%多聚甲醛，迅速斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24 h。在距額葉前端2.5 mm和8.5 mm處行冠狀切片，取中間5 mm厚的腦組織塊，沿矢狀縫左側(cè)約1.5 mm處切除右側(cè)部分，選取余下的左側(cè)腦塊作為檢測標(biāo)本，即缺血半暗帶腦組織。自前往后連續(xù)冠狀位切片，厚約6 μm，每隔10張取兩張切片，嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒提供的步驟進(jìn)行檢測，在400倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)視野，觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值并采圖。

1.4.2 TUNEL染色 嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作。在400倍光鏡下觀察凋亡細(xì)胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），并計(jì)算計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值并采圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)比較分別采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)與重復(fù)測量資料方差分析，組間因素為分組（PGZ組和對照組），組內(nèi)因素為時(shí)間點(diǎn)（7個(gè)不同處死時(shí)間點(diǎn)），交互作用為分組×?xí)r間；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α蛋白的表達(dá)

PGZ組大鼠缺血灶周圍組織中TNF-α在術(shù)后1 h中開始表達(dá)，3 h出現(xiàn)大量表達(dá)；6～24 h處于高度表達(dá)，再灌注損傷后3 d呈強(qiáng)表達(dá)，至7 d表達(dá)量有所降低，并顯著低于對照組（P<0.05）；通過重復(fù)測量資料的方差分析結(jié)果顯示，兩組同一時(shí)間點(diǎn)TNF-α蛋白表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=16.207，P=0.000<0.01）；兩組各不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α蛋白表達(dá)差異具有顯著性（F組內(nèi)1=13.999，P=0.000<0.01；F組內(nèi)2=12.337，P=0.000<0.01）；分組和時(shí)間之間不存在交互作用（F交互=1.759，P=0.188>0.05），即PGZ組和對照組TNF-α蛋白的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)上的變化趨勢是相同的，見表1、圖1。

2.2 IL-10蛋白的表達(dá)

IL-10蛋白在損傷灶周圍組織細(xì)胞核中1 h時(shí)高表達(dá)，但3～12 h陽性細(xì)胞數(shù)逐漸降低，24 h時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到低峰，處于低表達(dá)狀態(tài)，但7 d表達(dá)有所上升，并顯著高于對照組（P<0.05）；通過重復(fù)測量資料的方差分析結(jié)果顯示，兩組同一時(shí)間點(diǎn)IL-10蛋白表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=9.819，P=0.002<0.01）；二組各不同時(shí)間點(diǎn)IL-10蛋白表達(dá)差異具有顯著性（F組內(nèi)1=105.707，P=0.000<0.01；F組內(nèi)2=112.307，P=0.000<0.01）；分組和時(shí)間之間不存在交互作用（F交互=0.405，P=0.526>0.05），即PGZ組和對照組IL-10蛋白的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)上的變化趨勢是相同的，見表1及圖2。

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化

PGZ組大鼠損傷灶周圍組織1 h開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，3～24 h凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，3 d達(dá)到高峰，但7 d凋亡細(xì)胞數(shù)較前有所減少，并顯著低于對照組（P<0.05）；采用重復(fù)測量資料的方差分析結(jié)果顯示，兩組同一時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=6.585，P=0.012<0.01）；兩組各不同時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)比較差異具有顯著性（F組內(nèi)1=19.979，P=0.000<0.01；F組內(nèi)2=21.136，P=0.000<0.01）；分組和時(shí)間之間不存在交互作用（F交互=0.540，P=0.465>0.05），即PGZ組和對照組凋亡細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)上的變化趨勢是相同的，見表1及圖3。

2.4 TNF-α與IL-10蛋白的表達(dá)相關(guān)性分析

兩組腦組織TNF-α與IL-10蛋白的表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，以TNF-α蛋白的表達(dá)為自變量（independent variable），用X表示。IL-10蛋白的表達(dá)為應(yīng)變量（dependent variable），用Y表示。回歸方程Y1=0.43-0.261X，r2=-0.937（P<0.01），Y1=4.16-0.738X，r2=-0.951（P<0.01）。

3 討論

目前缺血性腦血管病已逐步成為導(dǎo)致人類死亡疾病中的首要因素[3]，造成勞動(dòng)力喪失并花費(fèi)巨額的醫(yī)療資源，對家庭和社會(huì)造成巨大的影響。因此，如何提高急性缺血性腦血管病的療效是臨床亟需解決的難題，而神經(jīng)保護(hù)劑在缺血性腦血管疾病急性期的治療中具有重要作用，故尋找有效的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑是當(dāng)代神經(jīng)科學(xué)的重要課題之一。

腦缺血特別是缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的病理生理過程極為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制涉及腦組織炎癥反應(yīng)、能量代謝紊亂、興奮性氨基酸（EAA）的細(xì)胞毒性等多個(gè)學(xué)說。這些環(huán)節(jié)并不是孤立存在的，而是密不可分，互為因果，彼此重疊，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死[4]。大量研究表明，腦缺血后炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中具有重要地位[5]。我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究也已證實(shí)，缺血再灌注后核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤參與了腦缺血再灌注損傷過程[6]。其中TNF-α由神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效性促炎性細(xì)胞因子，其表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，隨著TNF-α表達(dá)的減弱，所觸發(fā)炎性反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡損傷也逐漸緩解[7]。此外，IL-10作為一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶、自由基等有毒物質(zhì)；減輕興奮性神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損害；下調(diào)炎性細(xì)胞因子，阻止炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，對神經(jīng)細(xì)胞具有一定程度的保護(hù)作用[8]。因此，在防治大鼠缺血再灌注腦損傷中細(xì)胞凋亡中，我們可以通過減少有害細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加有利細(xì)胞因子，從而達(dá)到減少缺血再灌注神經(jīng)元凋亡所引起的繼發(fā)性腦損傷[9]。保護(hù)受損細(xì)胞，是目前治療缺血性腦血管疾病的一大靶點(diǎn)。

此外，細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是細(xì)胞在體內(nèi)外多種因素刺激誘導(dǎo)下，由多種基因嚴(yán)格調(diào)控而發(fā)生的有序變化的死亡過程。有文獻(xiàn)報(bào)道[10，11]，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮能促進(jìn)PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)，活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶而抑制炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)其對腦缺血再灌注損傷后腦神經(jīng)的保護(hù)效應(yīng)，并且與劑量呈正比關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)PGZ處理后的各時(shí)間段大鼠腦組織TNF-α的表達(dá)較對照組顯著降低，而IL-10的表達(dá)則相應(yīng)增高，且兩者的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，大鼠腦缺血半暗帶中神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減輕。由此我們推測，PGZ可通過下調(diào)TNF-α的釋放能力，上調(diào)抗炎介質(zhì)（IL-10）的表達(dá)，發(fā)揮免疫抗炎作用，從而減少細(xì)胞凋亡。

由此可見，吡格列酮可負(fù)性調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中TNF-α蛋白的表達(dá)，顯著上調(diào)抗炎介質(zhì)（IL-10）的釋放，減輕了缺血后再灌注損傷，從而較大程度地減輕細(xì)胞凋亡，為該藥在腦缺血再灌注損傷的治療中提供了廣闊的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-09-25）

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（收稿日期：2014-09-25）