李潁，郭曉，張彥芳，馬滕臻，張莉，祝霞，韓舜愈，楊學(xué)山

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，

甘肅 蘭州　730070)

葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶工藝的條件優(yōu)化

李潁1，郭曉2，張彥芳1，馬滕臻1，張莉1，祝霞1，韓舜愈1，楊學(xué)山2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，

甘肅 蘭州730070)

摘要：以葡萄酒泥酵母為試驗(yàn)材料，采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酵母細(xì)胞自溶的工藝條件.結(jié)果表明：在溫度47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH 4.5，處理時(shí)間33h的最優(yōu)條件下，酵母自溶前后電導(dǎo)率增加2.49 ms/cm，氨基氮含量增加2.154 90 mg/mL，自溶效果最好.此方法成本低，易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn).

關(guān)鍵詞：葡萄酒泥酵母；自溶；電導(dǎo)率；氨基氮

第一作者：李潁(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及利用.E-mail:16088164@qq.com

Optimization of processing techniques for autolysis of

yeast cell from waste wine yeast

LI Ying1,GUO Xiao2,ZHANG Yan-fang1,MA Teng-zhen1,ZHANG Li1,

ZHU Xia1,HAN Shun-yu1,YANG Xue-shan2

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.College of

Life Science & Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：The main factors that influence autolysis of yeast cell were screened by single factor and orthogonal tests.The results showed that the optimal temperature was 47.5 ℃,the mass fraction of NaCl was 2%,pH was 4.5,react time was 33 h.Under these conditions,obtained extract's conductivity increased 2.49 ms/cm,amino nitrogen content increased 2.15 490 mg/mL after autolysis.The process was inexpensive and simple and could be applied to industrialized production.

Key words：wine yeast;autolysis;conductivity;amino nitrogen

葡萄酒泥酵母是葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中主要的副產(chǎn)物[1]，每生產(chǎn)100 kL的葡萄酒，可形成2.5～4.0 t的葡萄酒泥酵母[2].酵母細(xì)胞富含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，是功能性食品添加劑的重要來(lái)源之一[3].在實(shí)際生產(chǎn)中，大多數(shù)企業(yè)將酒泥酵母直接丟棄，不僅浪費(fèi)了寶貴的生物資源，而且造成了環(huán)境污染.因此，急需開(kāi)展葡萄酒泥酵母資源化利用研究.

利用葡萄酒泥酵母可開(kāi)發(fā)超氧化物歧化酶等活性物質(zhì)[4]，但對(duì)細(xì)胞壁多糖的開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)報(bào)道.酵母細(xì)胞壁多糖具有提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、吸附毒素、抗輻射、抗氧化和降血脂等生理功能，是開(kāi)發(fā)功能食品、保健品的重要原料[5-7].采用全細(xì)胞制備酵母多糖的傳統(tǒng)方法，不僅酸堿用量大、污染環(huán)境，而且會(huì)引起多糖降解，影響其生理活性[8].因此，利用誘導(dǎo)劑激活處于胞內(nèi)鈍化狀態(tài)的自溶酶，降解、去除細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，以細(xì)胞壁作為原料提取多糖是獲得高純度產(chǎn)品的有效途徑[9-11].酵母自溶后細(xì)胞內(nèi)離子及氨基酸溶出細(xì)胞，且隨著自溶程度增強(qiáng)，上清液的電導(dǎo)率和氨基氮含量也隨之提高，是評(píng)價(jià)酵母自溶效果的可靠指標(biāo)[12-13].本試驗(yàn)以葡萄酒酒泥酵母為原料，選擇安全、廉價(jià)的NaCl為誘導(dǎo)劑，以自溶前后電導(dǎo)率及氨基氮含量的變化為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化建立了葡萄酒泥酵母自溶工藝條件，以期為分離提取高品質(zhì)酵母多糖提供技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒酵母泥由甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司提供；醋酸、醋酸鈉、甲醛、麝香草酚酞、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；TDZ5-WS湘儀離心機(jī)；SL-1001電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C pH計(jì)(上海雷磁有限公司)；DDS-11A電導(dǎo)儀(杭州奧利龍儀器有限公司).

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1操作步驟葡萄酒泥→預(yù)處理→收集濕酵母→加入緩沖液→誘導(dǎo)自溶→加熱滅酶→離心分離→上清液→測(cè)定上清液電導(dǎo)率及氨基氮含量

1.2.2操作要點(diǎn)

1.2.2.1葡萄酒泥的預(yù)處理收集葡萄酒酒泥，與蒸餾水以1∶1混合，用80目篩篩分，4 000 r/min離心15 min.重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無(wú)色透明為止，收集濕酵母?jìng)溆肹14].

1.2.2.2自溶前處理取3.0 g濕酵母于50 mL具塞離心管中，量取30 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液懸浮菌體，攪拌均勻，4 000 r/min離心15 min[15].取上清液，測(cè)定自溶前上清液電導(dǎo)率及氨基氮含量.

1.2.2.3自溶于離心管中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl、以及不同的溫度、pH和時(shí)間處理，誘導(dǎo)酵母自溶.自溶后85 ℃水浴滅酶15 min，4 000 r/min離心15 min.

1.2.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[3,15]方法，選擇影響酵母自溶的主要影響因素，以自溶前后電導(dǎo)率及氨基氮含量變化值為依據(jù)，各因素水平設(shè)置如下：NaCl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4%，溫度為42.5、45.0、47.5、50.0、52.5 ℃，緩沖液pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，自溶時(shí)間24、27、30、33、36 h.

1.2.4正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定酵母自溶的正交試驗(yàn)因素和水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酵母自溶的最優(yōu)工藝，重復(fù)3次.

1.2.5測(cè)定方法

1.2.5.1電導(dǎo)率測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行.

1.2.5.2氨基氮含量測(cè)定甲醛滴定法[16]，具體計(jì)算方法如下：

式中：V末為滴定待測(cè)液耗用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)；V對(duì)為滴定對(duì)照液耗用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)；MNaOH為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的摩爾濃度.

1.2.6Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量計(jì)算

Δ電導(dǎo)率=自溶后上清液電導(dǎo)率-自溶前上清液電導(dǎo)率；

Δ氨基氮含量=自溶后上清液氨基氮含量-自溶前上清液氨基氮含量.

2結(jié)果與分析

2.1單因素結(jié)果與分析

2.1.1NaCl添加量對(duì)酵母自溶效果的影響由圖1可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，Δ電導(dǎo)率為1.51 ms/cm，Δ氨基氮含量為1.610 92 mg/mL，自溶效果好，所以選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的NaCl為酵母自溶的較佳添加量.這主要是由于NaCl有利于酵母的質(zhì)壁分離，從而促進(jìn)酵母內(nèi)自溶酶類與蛋白質(zhì)等底物的充分接觸.當(dāng)NaCl添加量小于3%時(shí)，適量的鹽濃度對(duì)酶類具有促進(jìn)作用，能夠較明顯地促進(jìn)酶促反應(yīng)；當(dāng)NaCl添加量大于3%時(shí)，酵母質(zhì)壁已分離完全，促進(jìn)作用沒(méi)有明顯差異，同時(shí)較大的鹽濃度會(huì)對(duì)酶作用的發(fā)揮具有一定的抑制作用.

圖1　NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)自溶效果的影響

2.1.2溫度對(duì)酵母自溶效果的影響由圖2可知，處理溫度不同，電導(dǎo)率和氨基氮含量的變化不同.當(dāng)溫度為47.5 ℃時(shí)，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量值最大，自溶效果最明顯，所以選擇47.5 ℃為葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶的較佳處理溫度.當(dāng)溫度小于47.5 ℃時(shí)，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量隨溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明在此溫度范圍內(nèi)，酵母細(xì)胞內(nèi)酶類的活性隨著溫度的升高逐漸增大；溫度高于47.5 ℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)自溶酶失活，從而影響自溶效果.

圖2　溫度對(duì)自溶效果的影響

2.1.3pH對(duì)酵母自溶效果的影響由圖3可知，緩沖液的pH不同時(shí)，酵母自溶效果存在差異.當(dāng)pH 5.0時(shí)，自溶效果最好，所以選擇pH 5.0為葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶的較佳pH.究其原因，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，達(dá)到了酵母細(xì)胞內(nèi)自溶酶的適宜pH值，自溶酶充分水解底物；當(dāng)pH偏離5.0時(shí)，酶活性均降低，影響自溶效果.

圖3　pH對(duì)自溶效果的影響

2.1.4時(shí)間對(duì)酵母自溶效果的影響由圖4可知，自溶時(shí)間為30 h時(shí)，自溶效果最好，所以選擇30 h為酵母誘導(dǎo)自溶的較佳時(shí)間.誘導(dǎo)自溶小于30 h時(shí)，有足夠含量的底物與蛋白水解酶充分反應(yīng)，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量呈上升趨勢(shì).自溶大于30 h后，酵母中的可溶性物質(zhì)幾乎全部釋放，自溶液出現(xiàn)氮味和苦味，不具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量的降低，可能是酵母細(xì)胞中一些酶，進(jìn)一步將水解得到的氨基酸分解了，導(dǎo)致氨基態(tài)氮得率下降.

圖4　間對(duì)自溶效果的影響

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以自溶前后上清液的電導(dǎo)率及氨基氮含量的變化量為考察指標(biāo)，進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)直觀分析和極差分析得到最優(yōu)組合，在最優(yōu)組合的試驗(yàn)條件下酵母自溶效果和其他試驗(yàn)組合對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，確定酵母自溶的最優(yōu)工藝.

由表1的數(shù)據(jù)結(jié)果可得出影響電導(dǎo)率變化因素的主次順序?yàn)椋篊>B>D>A，由K值可以確定其正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B1C1D3；影響氨基氮含量變化因素的主次順序?yàn)椋築>C>A>D，由K*值可以確定其正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B1C1D3.經(jīng)綜合平衡法分析得出影響酵母自溶效果的正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合是A2B1C1D3，即溫度為47.5℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH為4.5，處理時(shí)間為33 h.

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知，因素B和C在P<0.05的水平上有顯著性差異，因素A和D不顯著.

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由于正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合在L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)，所以需對(duì)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).在溫度為47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH為4.5，處理時(shí)間為33 h的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證酵母自溶效果，重復(fù)3次.測(cè)得電導(dǎo)率變化量為2.49 ms/cm，氨基氮含量變化量為2.154 90 mg/mL，比正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合的自溶效果好.可見(jiàn)，經(jīng)正交試驗(yàn)所確定的是最佳工藝參數(shù).

表1　L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2　正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

*：差異顯著(P<0.05).

3結(jié)論

本試驗(yàn)確定的葡萄酒泥酵母細(xì)胞自溶的最優(yōu)工藝參數(shù)為溫度47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH 4.5，處理時(shí)間33 h，在此條件下所得酵母抽提液自溶前后電導(dǎo)率增加2.49 ms/cm，氨基氮含量增加2.154 90 mg/mL，自溶效果最好.

參考文獻(xiàn)

[1]張燕,朱濟(jì)義.中國(guó)葡萄酒行業(yè)現(xiàn)狀、存在的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)[J].釀酒科技,2009,11(187):128-131

[2]游玲,王濤,李華蘭.葡萄酒芳香物質(zhì)研究進(jìn)展[J].四川食品與發(fā)酵,2008,44(2):29-33

[3]楊建梅,李紅,杜金華.啤酒廢酵母自溶條件的研究[J].中國(guó)釀造,2012,31(2):95-99

[4]杜娜,楊學(xué)山,韓舜愈,等.超聲波輔助酶法分離提取葡萄酒泥酵母SOD工藝條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2014,35(2):87-90

[5]徐寶國(guó),許引虎,鄔善遠(yuǎn).葡萄酒多糖的研究與利用現(xiàn)狀[J].釀酒,2010,37(3):13-15

[6]劉紅芝.釀酒酵母甘露聚糖的制備、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2009

[7]汪文俊,劉玉蘭,肖靚,等.紅法夫酵母甘露聚糖的提取與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(5):584-586

[8]Stefan F,Sandro J,Eva A,et al.Optimised quantification method for yeast-derived 1,3-β-D-glucan and α-D-mannan[J].Eur Food Res Technol,2005,220(1):101-105

[9]孫向軍,姚曉敏,張偉.酵母細(xì)胞自溶條件的研究[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,18(1):36-39

[10]邵偉,樂(lè)超銀,陳菽.酵母細(xì)胞自溶條件優(yōu)化研究[J].中國(guó)釀造,2007,26(8):10-14

[11]Aguilar U,Francois J.A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation[J].Letters in Applied Microbiology,2003,37(3):268-274

[12]許維娜,王金晶,陳希,等.啤酒酵母自溶液中的物質(zhì)變化及酵母自溶評(píng)價(jià)指標(biāo)探索[J].食品科學(xué)與生物技術(shù),2013,32(6):574-580

[13]王敏,鄭飛云,劉春鳳,等.啤酒酵母自溶分析評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(10):73-75

[14]杜娜,楊學(xué)山,韓舜愈,等.葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分離提取工藝條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2013,34(15):242-245

[15]Liu X Y,Wang Q,Liu H Z,et al.A new isolation method ofβ-D-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Food Hydrocolloids,2008,22(2):239-247

[16]黃偉坤.食品檢驗(yàn)與分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1989:57-58

(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-06-11；修回日期：2014-07-01

基金項(xiàng)目：甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2013-21)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(20140831) .

通信作者：楊學(xué)山，男，副教授，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與生物產(chǎn)品研發(fā).E-mail:yangxs@gsau.edu.cn

中圖分類號(hào)：TS 261.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2015)03-0155-05