殷和平，曾驥孟，胡鵬，李志明，潘耀振，孫誠誼（.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004；.廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建廈門6000；.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州貴陽550004）

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析膽囊結(jié)石中非黏性蛋白的組成*

殷和平1，曾驥孟2，胡鵬2，李志明2，潘耀振3，孫誠誼3
（1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004；2.廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建廈門361000；3.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州貴陽550004）

摘要：目的探討膽固醇結(jié)石和膽色素結(jié)石中是否存在非黏性蛋白并鑒定蛋白質(zhì)的組成。方法選取30例行保膽取石術(shù)患者的膽囊結(jié)石，男性11例，女性19例。采用肉眼觀察并結(jié)合三酰甘油檢測試劑盒（GPO-PAP）測定膽固醇含量的方法對(duì)膽結(jié)石進(jìn)行分類，分為20例膽固醇型和10例膽色素型。應(yīng)用組織裂解法（RIPA）提取膽囊結(jié)石蛋白，并用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF）分析相結(jié)合的方法對(duì)該蛋白進(jìn)行鑒定分析。通過DAVID工具對(duì)上述基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析本圖及京都基因、基因組百科全書（KEGG）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。結(jié)果膽固醇結(jié)石和膽色素結(jié)石中出現(xiàn)特異性蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為轉(zhuǎn)鐵蛋白前體蛋白（TRFE）、白蛋白（ALB）、抗胰蛋白酶1（SERPINA1）、免疫球蛋白γ-1（IGHG1）、α血紅蛋白（HBA1）、β血紅蛋白（HBB），其中IGHG1不存在于膽色素結(jié)石中。結(jié)論TRFE、ALB、SERPINA1、HBA1、HBB等蛋白共同存在于膽固醇和膽色素結(jié)石中，而IGHG1只存在于膽固醇結(jié)石中，可見IGHG1蛋白或其對(duì)應(yīng)基因是參與不同膽結(jié)石類型成因的重要元素及生物標(biāo)志物。KEGG分析結(jié)果表明，SERPINA1參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。鑒定和分析膽囊結(jié)石中非黏性蛋白的成分及利用資料庫的模擬對(duì)闡明膽囊結(jié)石的發(fā)病機(jī)制有重要的意義。

關(guān)鍵詞：膽囊結(jié)石；非黏性蛋白；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜

膽石癥是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，歐美成年人的發(fā)病率為10%～15%[1-4]，中國人群發(fā)病率為3%～11%[5]。隨著中國居民生活水平的提高，膽石癥的發(fā)病率也呈逐年升高的趨勢[6]。國內(nèi)外有學(xué)者采用各種不同的儀器和方法，對(duì)膽囊結(jié)石的成分進(jìn)行研究[7-12]，大量的實(shí)驗(yàn)證明膽囊結(jié)石中含有膽固醇、膽色素、蛋白或多肽及一些金屬礦物質(zhì)等。早期，LEE 等[13-14]發(fā)現(xiàn)在膽汁和膽固醇結(jié)石中存在黏蛋白，且膽囊分泌大量黏蛋白，可能是固醇結(jié)晶成核化的原因及膽固醇型結(jié)石形成的早期特征。近年來，蛋白在膽汁中作為重要的促成核因子已得到廣泛的研究，而隨后MURRAY等[15]研究表明，膽固醇型結(jié)石除含有黏蛋白外，還含有大量的小分子非黏蛋白，其中最大的蛋白可能是白蛋白（albumin，ALB），并推測非黏蛋白有可能參與膽固醇結(jié)石的形成，但對(duì)膽結(jié)石中非黏蛋白的成分并未研究清楚。至今，國內(nèi)外依然沒有人能夠闡明膽固醇和膽色素結(jié)石中非黏蛋白的信息。因此，本研究采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF）相結(jié)合的方法，對(duì)膽囊結(jié)石中存在的蛋白進(jìn)行鑒定分析并闡述其具體信息，以期為后續(xù)研究蛋白在結(jié)石形成中可能發(fā)揮的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選自2013年5月-2014年2月因膽囊結(jié)石在貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行保膽取石術(shù)患者30例，選取其肉眼觀典型的結(jié)石樣本，其中膽固醇結(jié)石20例，膽色素結(jié)石10例（見圖1）。所有患者簽屬知情同意書。應(yīng)用三酰甘油檢測試劑盒（GPO-PAP）測定膽固醇含量，對(duì)選取的膽囊結(jié)石樣本進(jìn)行鑒定。膽固醇含量≥70%為膽固醇型結(jié)石，膽固醇含量≤30%為膽色素型結(jié)石[16]。膽囊結(jié)石取出后均立即用4℃PBS水沖洗，37℃干燥6 h后，置于-80℃冰箱冷凍備用。

1.2試劑

總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo公司，氯仿、甲醇、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、組織裂解液（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）、考馬斯亮藍(lán)R-250、硝酸銀、冰醋酸、乙醇、氨水、醋酸鈉、戊二醛、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉購自上海生工生物工程有限公司

1.3儀器

Victor 3V多功能酶標(biāo)儀、4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer購自美國ABI公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，電熱恒溫水浴箱、水平脫色搖床購自廈門合力信儀器儀表有限公司，PowerPac系列Bio-Rad電泳儀購自美國Bio-Rad公司，Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司，Geno Sens 1860凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1膽囊結(jié)石的膽固醇提取切取部分膽結(jié)石放入預(yù)冷的研缽中磨成粉末，每個(gè)樣本精確稱取10 mg，盛于15 ml離心管中，加入氯仿、甲醇混合液（體積比2∶1）14 ml，充分振搖1～2 min后，避光常溫室內(nèi)存放20 min，再振搖1～2 min后，6 000 r/min離心10 min，取上清液，按照T-CHO試劑盒說明書，采用單試劑GPO-PAP法測定膽固醇含量。

1.3.2RIPA法提取膽囊結(jié)石蛋白每份取等量的膽固醇結(jié)石和膽色素充分混合后，分別稱取100 mg的膽固醇和膽色素結(jié)石粉末轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管。每管分別加入400μl組織裂解液（radio-immunoprecipitation assay，RIPA），4℃冰箱孵育1 h，12 000 g，4℃離心30 min，上清液即為提取的蛋白，轉(zhuǎn)上清液于新管中置于-80℃冰箱冷凍保存。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定蛋白濃度。

1.3.3 SDS-PAGE電泳分離蛋白將膽固醇和膽色素結(jié)石蛋白，加入6×loading buffer，95℃，5 min。兩種結(jié)石分別取600、300、120和100 ng，上樣。采用5%的聚丙烯酰胺濃縮膠和15%的聚丙烯酰胺分離膠進(jìn)行電泳，分離蛋白。

1.3.4蛋白質(zhì)考馬斯染色和銀染并質(zhì)譜鑒定考馬斯染色：采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色15 min后再用考馬斯脫色液脫色4次，每次10 min，最后一次脫色過夜。蛋白質(zhì)銀染：把膠片置于無菌的盤中，25 ml固定液固定30 min，25 ml左右增敏液孵育30 min，去離子水洗脫3次，每次10 min，硝酸銀染色液25 ml染色40 min，25 ml的顯影液顯影15 min，25 ml左右的終止液終止10 min，去離子水洗3次，每次5 min，采用Geno Sens 1860凝膠成像系統(tǒng)成像（見圖3）。將染色后清晰出現(xiàn)的蛋白質(zhì)條帶切割下來，進(jìn)行膠內(nèi)酶解提取肽段，并采用MALDI-TOFTOF對(duì)樣品條帶進(jìn)行分析，激光源為355 nm波長的Nd：YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)模式采集數(shù)據(jù)，PMF質(zhì)量掃描范圍800～4 000 Da，選擇信噪比>50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)MS/MS激光激發(fā)2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。

1.3.5生物信息學(xué)分析采用在線數(shù)據(jù)分析軟件Mascot數(shù)據(jù)庫（http：//www.matrixscience.com）進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜離子（MS/MS Ions Search）檢索分析對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)信息，Mascot數(shù)據(jù)庫打分算法是分子量檢索（molecular weight search，MOWSE）算法的改進(jìn)，基于非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中肽分布頻率及可能性對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合打分。所用檢索條件見表1，最終得出的蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

表1　Mascot數(shù)據(jù)庫檢索條件

2　結(jié)果

2.1膽囊結(jié)石類型

應(yīng)用GPO-PAP法測定肉眼選取的30例膽囊結(jié)石的膽固醇含量，其中膽固醇結(jié)石20例（66.7%），膽色素結(jié)石10例（33.3%）。見圖1和表2。

圖1　典型的色素型結(jié)石及膽固醇型結(jié)石

表2　結(jié)石類型與膽固醇含量

2.2膽固醇和膽色素結(jié)石中的蛋白質(zhì)

對(duì)比兩種凝膠染色方法發(fā)現(xiàn)，兩種染色的蛋白譜大體類似，銀染靈敏度較高，能顯示更多的條帶，兩種類型結(jié)石中所含蛋白大小基本相同，含量最大的蛋白都出現(xiàn)于70 kD左右，所不同的是固醇型結(jié)石40 kD出現(xiàn)明顯蛋白條帶，而色素型結(jié)石卻不存在。其余蛋白條帶分別出現(xiàn)在55、35、25和15 kD附近。見圖2。

圖2　SDS-PAGE考馬斯染色、銀染分析及取樣來源

2.3質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析

SDS-PAGE膠上蛋白條帶經(jīng)過質(zhì)譜鑒定得到優(yōu)質(zhì)的肽段質(zhì)量指紋圖譜，以70 kD為例（見圖3A），對(duì)70 kD條帶中肽段RHPDYSVVLLLR（分子量1 467.833 1）進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（見圖3B），結(jié)果y離子全序列匹配，得到較高分?jǐn)?shù)鑒定結(jié)果。將所得肽段分子量數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mascot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，并根據(jù)SDS-PAGE膠上蛋白條帶所顯示的分子量最終分析這些蛋白結(jié)果（見表3）。SDS-PAGE膠上蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的蛋白分別為轉(zhuǎn)鐵蛋白前體蛋白（sero transferrin precursor，TRFE）、白蛋白（albumin，ALB）、抗胰蛋白酶1（alpha-1-antitrypsin，SERPINA1）、免疫球蛋白γ-1（ig gamma-1 chain C region，IGHG1）、α血紅蛋白（hemoglobin subunit alpha，HBA1）和β血紅蛋白（hemoglobin subunit β，HBB）。一般認(rèn)為當(dāng)搜索結(jié)果匹配分?jǐn)?shù)（score）≥55分時(shí)，待測蛋白質(zhì)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中某種已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列覆蓋率較高，認(rèn)為匹配的可能性很大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）[17]。結(jié)果中除TRFE外其余匹配分?jǐn)?shù)>55分。

2.4生物信息學(xué)分析

表3　非黏性蛋白MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖3　利用MALDI-TOF/TOF分析由膠內(nèi)挖取蛋白條帶的肽段指紋

用DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對(duì)質(zhì)譜鑒定的基因進(jìn)行GO注釋描述和分類，使用KEGG公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/）對(duì)這些基因進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO分析得知這些蛋白免疫先關(guān)蛋白，抑制酶類蛋白。KEGG表明，SERPINA1參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其不僅是一種代謝酶類抑制劑，同時(shí)還參與先天免疫的調(diào)控（見圖4）。

圖4　SERPINA1在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用

3　討論

人體膽結(jié)石的主要成分為黏蛋白、膽固醇、膽色素、鈣離子。膽石癥?？梢饑?yán)重的并發(fā)癥，因此，必須從根本上研究膽石癥的成石原因，為預(yù)防和治療膽石癥提供理論基礎(chǔ)，而對(duì)膽結(jié)石的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、成分、含量等進(jìn)行確切的分析是認(rèn)識(shí)膽結(jié)石形成的重要基礎(chǔ)。目前，研究表明某些蛋白通過調(diào)控膽固醇代謝在膽結(jié)石的形成中發(fā)揮重要作用。但最近膽結(jié)石發(fā)病機(jī)理制的研究一直局限于膽汁和膽囊組織及黏膜中蛋白的研究，這些蛋白可能僅僅只是膽結(jié)石在膽囊內(nèi)形成后的一種的反應(yīng)，并不能準(zhǔn)確地反映膽結(jié)石形成的機(jī)制。更令人感興趣的是，這些蛋白是否存在于結(jié)石本身呢，這些蛋白到底是什么蛋白，其在膽囊結(jié)石的形成中扮演什么樣的角色，是促進(jìn)膽囊結(jié)石的形成還是抑制形成？這些都是未知的。早期LEE等[13-14]研究證明，膽結(jié)石中存在蛋白質(zhì)，同時(shí)推測這些蛋白質(zhì)可能反映膽結(jié)石在膽囊內(nèi)形成時(shí)膽囊膽汁的理化狀態(tài)，但并沒有給出這些蛋白的具體信息。因此，鑒定這些蛋白質(zhì)會(huì)使人們更加深入地理解膽囊結(jié)石形成的發(fā)病機(jī)制。

MURRAY等[15]利用高效液相色譜法證明膽固醇結(jié)石中不僅有黏蛋白，而且還含有非黏蛋白，其主要成分可能是人血清ALB。但是常見的膽色素結(jié)石并沒有納入研究中，而且這種方法存在著一定的局限性，其只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子量大小來推測可能的蛋白質(zhì)。目前，質(zhì)譜MALDI-TOF/TOF技術(shù)以其操作簡便、分析速度快、敏感度高及豐富的數(shù)據(jù)庫資源等優(yōu)點(diǎn)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中強(qiáng)有力的工具之一。其依靠蛋白質(zhì)分子量和氨基酸與蛋白質(zhì)的匹配率來精確鑒定蛋白質(zhì)。對(duì)于串聯(lián)質(zhì)譜檢索，蛋白得分并不是嚴(yán)格意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，只是對(duì)蛋白質(zhì)匹配排序的依據(jù)。當(dāng)?shù)梅?55分時(shí)，匹配的可能性較小，此時(shí)有3種可能：①可能是該蛋白類似物；②與該蛋白cDNA同源，但為不成熟蛋白；③可能是某種新的未知蛋白或不成熟蛋白。雖然TRFE得分僅39分，但是TRFE為血清TRFE，其在核糖體內(nèi)尚未裝配和修飾完善，屬不成熟蛋白，因此并不表示膽結(jié)石中不存在該蛋白，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。與MURRAY不同的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人血清ALB不但存在于膽固醇結(jié)石中，而且存在于膽色素結(jié)石，與此同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)IGHG1、SERPINA1、TRFE、HBA1、HBB等蛋白同樣存在于兩種膽囊結(jié)石中。人血清ALB中鈣離子、脂肪酸、膽紅素等有良好的結(jié)合能力，其大量存在很可能與膽結(jié)石組成有重要聯(lián)系[15]。另外，KEUL-EMANS等[18]發(fā)現(xiàn)，人血清ALB、免疫球蛋白、氨肽酶N和黏蛋白在36%的膽固醇結(jié)石患者的膽汁標(biāo)本中升高，并認(rèn)為局部炎癥導(dǎo)致黏蛋白、免疫球蛋白的產(chǎn)生，再通過疏水性作用俘獲ALB。KEGG是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫，后基因時(shí)代一個(gè)重大挑戰(zhàn)是如何通過計(jì)算機(jī)完整地表達(dá)和演繹細(xì)胞和有機(jī)體，利用基因信息對(duì)更高層次和更復(fù)雜的細(xì)胞活動(dòng)和生物體行為做出推測，建立一個(gè)網(wǎng)絡(luò)推測工具。其可以對(duì)蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)在各種細(xì)胞活動(dòng)中起的作用做出預(yù)測，通過GO分析可知IGHG1、HBB是免疫相關(guān)蛋白，而膽結(jié)石形成又與炎癥互為因果，因此這兩種蛋白很可能通過參與炎癥反應(yīng)調(diào)控膽結(jié)石的形成與發(fā)展。另外SDS-PAGE銀染結(jié)果顯示，固醇型結(jié)石比色素型結(jié)石多出一條蛋白條帶，經(jīng)鑒定該蛋白是IGHG1，表明固醇型結(jié)石很可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)?？梢奍GHG1蛋白或其對(duì)應(yīng)基因是參與不同膽結(jié)石類型成因的重要元素及生物標(biāo)志物。深入研究該蛋白將對(duì)膽囊結(jié)石的預(yù)防和治療帶來極大的幫助。SERPINA1和膽固醇脂質(zhì)有關(guān)，且是代謝酶類的抑制分子，那么其很可能以某種機(jī)制通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝參與膽囊結(jié)石的形成。

總之，膽囊結(jié)石的成因是多因素且復(fù)雜的，進(jìn)一步在膽囊組織或者膽汁中研究這些蛋白的起源及其在膽囊結(jié)石形成中的作用，可能為膽囊結(jié)石形成的發(fā)病機(jī)制提供新線索。本研究為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)和理論支持。

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（申海菊編輯）

Analysis of non-mucin protein in human gallstones by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry*

He-ping YIN1, Ji-meng ZENG2, Peng HU2, Zhi-ming LI2,

Yao-zhen PAN3, Cheng-yi SUN3

(1. Guiyang Medical College, Guiyang, Guizhou 550004, P.R. China; 2. School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361000, P.R. China; 3. Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital, Guiyang

Medical College, Guiyang, Guizhou 550004, P.R. China)

Abstract:【Objective】To examine the presence of non-mucin proteins in the cholesterol calculi and pigment gallstones, and to further identify the type of proteins.【Methods】Gallstones were obtained from 30 patients at endoscopic minimally invasive cholecystolithotomy, including 11 males and 19 females. The classification of gallstones was applied by visual observation and measurement of concentration of cholesterol through GPO-PAP method. There were 20 cases of cholesterol gallstones and 10 cases of pigment gallstones. The proteins in gallstones were extracted by RIPA, separated by SDS-PAGE and deciphered by matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight (MALDI-TOF-TOF) mass spectrometry. DAVID was used to analyze the GO (gene ontology) function annotation and the KEGG signal pathway of the targeted genes.【Results】book=47,ebook=53Non-mucin proteins, transferrin (TRFE) precursor protein, ALB, SERPINA1, HBA1 and HBB were found and identified in cholesterol stones and pigment stones; while IGHG1 was only observed in cholesterol stones. 【Conclusions】The six proteins have been first figured out to exist in human gallstones. Interestingly, IGHG1 and its associated genes, solely present in cholesterol gallstones may play a novel role in the classification and/or development of gallstone as a biomarker. In KEGG pathway, SERPINA1 is involved in pathway of complement and coagulation cascades. It is important to further study the origin and the functions of these non-mucin proteins for understanding the pathogenesis of gallstones.

Key words:gallstone; non-mucin protein; matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry

[通信作者]孫誠誼，E-mail：chengyisun@medmail.com.cn；Tel：0851-6771326

*基金項(xiàng)目：貴州省省長基金臨床應(yīng)用課題專項(xiàng)研究項(xiàng)目[No：黔省專合字（2012)94號(hào)]；國家國際科技合作項(xiàng)目（No：2014DFA31420）

收稿日期：2015-03-17

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0046-06

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中國分類號(hào)：R575.62A