韋貴將，梁麗娜，羅桂飛，陸 潞，韋葉生，唐毓金，王俊利△

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.桂西高發(fā)病防治實(shí)驗(yàn)中心，廣西百色533000）

骨橋蛋白是由一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞黏附分子，其廣泛分布于多種組織和細(xì)胞中。目前研究認(rèn)為骨橋蛋白在細(xì)胞黏附、遷移、細(xì)胞存活、血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用，與腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1-3］。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)的不斷發(fā)展，新的研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白基因存在多種功能性多態(tài)性位點(diǎn)，且這些多態(tài)性位點(diǎn)也可能參與甲狀腺乳頭狀瘤、尿路結(jié)石和缺血性腦卒中等疾病的發(fā)展進(jìn)程［4-6］。因此，準(zhǔn)確分析骨橋蛋白基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）在不同地區(qū)和不同人群中的分布，可以為基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展提供更多有力的研究數(shù)據(jù)。作者采用SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè)150 例廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)的遺傳SNP，并對(duì)比HapMap公布的4個(gè)人群（歐洲人群、非洲人群、日本人群和中國(guó)北京人群）的SNP 檢測(cè)結(jié)果，分析不同人群骨橋蛋白基因的SNP 差異，為與骨橋蛋白相關(guān)的遺傳和疾病等方面的研究提供參考資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年1月1日至2012年8月1日廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢的150名健康人為研究對(duì)象，其中男87名，女63名；年齡25～84歲，平均（52±15）歲，中位年齡40歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：3代世居廣西的壯族人群；本人無(wú)惡性腫瘤史。實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在受試者本人知情同意后采集標(biāo)本。

1.2 基因組DNA 的提取 抽取健康體檢者靜脈血2mL，使用碘化鈉法提取細(xì)胞基因組DNA，低溫保存待用。

1.3 PCR 反應(yīng) 根據(jù)NCBI上查找的骨橋蛋白基因DNA 序列，選擇包含rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)的序列并輸入引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5，得到用于特異性擴(kuò)增包含rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)骨橋蛋白基因的PCR 上下游引物和延伸引物。rs11728697位點(diǎn)的上游引物序列為：5′-AAC TGT GCC AGC CAA ACA ACA A-3′，下游引物序列為：5′-CCC TCC ACA CAC AAA CGA ACA C-3′，延伸引物序列為：5′-TTT TTT TTT TTG TTC AAT TCC AGT TGA ACA GAA TAA AGG-3′。rs9138位點(diǎn)的上游引物序列為：5′-GCA AAA TGA AAG AGA ACA TGA AAT GC-3′，下游引物序列為：5′-CTG GAC AAC CGT GGG AAA ACA A-3′，延伸引物序列為：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TAA GTG GGT AAA AGT ATT TTG TTT GC-3′。20μL 骨橋蛋白基因的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0μL，HotStar Taq DNA 聚合酶1.0 U，基因組DNA 1.0μL，不足體積用水補(bǔ)足到20.0μL。PCR 產(chǎn)物4 ℃保存。PCR 反應(yīng) 條 件 為：94 ℃15 min；94 ℃30s，60℃30s，72 ℃20s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃10min。

1.4 SNaPshot SNP分型技術(shù) PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用蝦堿酶純化后在ABI3130XL 上樣。SNP分型用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）來(lái)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果 包含骨橋蛋白基因rs11728697 位點(diǎn)和rs9138 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為185 bp 和428 bp。ABI 3130XL 的SNP 分型結(jié)果顯示，rs11728697位點(diǎn)的基因型有CC、CT 和TT，基因分型結(jié)果如圖1所示；rs9138位點(diǎn)的基因型有CC、CA 和AA，基因分型結(jié)果如圖2所示。

2.2 骨橋蛋白基因SNP在廣西壯族人群中的分布 在廣西壯族人群中，骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)的CC基因型最常見(jiàn)，約為42.7%；C等位基因的頻率最高，約為62.7%。rs9138位點(diǎn)的CA 基因型最常見(jiàn)，約為51.3%；C 等位基因的頻率最高，約為63.0%。骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)基因型頻率（χ2＝3.363，P＝0.162）和等位基因頻率（χ2＝0.054，P＝0.816）男女組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs9138位點(diǎn)基因型頻率（χ2＝0.048，P＝0.976）和等位基因頻率（χ2＝0.008，P＝0.927）男女組間比較也差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1、2。

2.3 廣西壯族人群骨橋蛋白基因SNP 與其他4個(gè)人群的比較 廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲人群、日本人群和非洲人群的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與中國(guó)北京人群的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。rs9138位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲人群和非洲人群的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與日本人群和中國(guó)北京人群的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

圖1 骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)SNP分型結(jié)果

圖2 骨橋蛋白基因rs9138位點(diǎn)SNP分型結(jié)果

表1 rs11728697位點(diǎn)在廣西壯族人群中的分布［n（%）］

表2 rs9138位點(diǎn)在廣西壯族人群中的分布［n（%）］

表3 廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)SNP與其他人群的比較［n（%）］

表4 廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs9138位點(diǎn)SNP與其他人群的比較［n（%）］

3 討 論

骨橋蛋白是由一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞黏附分子，其化學(xué)本質(zhì)為分泌型磷酸化糖蛋白，并廣泛分布于多種組織和細(xì)胞中。骨橋蛋白基因位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成，編碼由300個(gè)氨基酸殘基組成相對(duì)分子質(zhì)量約44×103的骨橋蛋白分子［7-8］。骨橋蛋白分子主要由信號(hào)肽序列、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，它可以通過(guò)依賴性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸途徑和非依賴性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸途徑介導(dǎo)多種細(xì)胞生理功能［9-10］。目前研究認(rèn)為骨橋蛋白在細(xì)胞黏附、遷移、細(xì)胞存活、血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用，與腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1-3］。大量研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腺囊癌等多種腫瘤組織和患者血漿中都伴有骨橋蛋白表達(dá)水平明顯升高，且骨橋蛋白的高表達(dá)與腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，患者預(yù)后差［11-15］。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)的不斷發(fā)展，新的研究證實(shí)，骨橋蛋白基因存在多種功能性多態(tài)性位點(diǎn)，且這些多態(tài)性位點(diǎn)也可能參與甲狀腺乳頭狀瘤、尿路結(jié)石和缺血性腦卒中等疾病的發(fā)展進(jìn)程。Mu等［4］通過(guò)對(duì)363 例甲狀腺乳頭狀瘤患者和413例健康人的骨橋蛋白基因SNP 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病例組rs11730582位點(diǎn)TT 基因型顯著高于對(duì)照組，骨橋蛋白基因SNP與甲狀腺乳頭狀瘤的易感性相關(guān)。Tugcu等［5］通過(guò)分析172例尿路結(jié)石患者和210 例健康人的骨橋蛋白基因SNP發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白基因rs1126616位點(diǎn)SNP 與尿路結(jié)石的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。而在Jing等［6］的報(bào)道中，通過(guò)分析中國(guó)人群骨橋蛋白rs11730582位點(diǎn)SNP，發(fā)現(xiàn)CT 基因型顯著增加中國(guó)人群缺血性腦卒中的易感性。因此，準(zhǔn)確分析骨橋蛋白基因SNP在不同國(guó)家或地區(qū)中的分布，可以為基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展提供更多有力的研究數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果顯示，骨橋蛋白基因型頻率男女組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明此位點(diǎn)基因型分布與性別沒(méi)有關(guān)系；廣西壯族人群的基因型和等位基因頻率與歐洲人群、非洲人群的差異明顯，與日本人群和中國(guó)北京人群的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明此位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與人種有密切關(guān)系，即親緣關(guān)系越近，基因型和等位基因頻率越相近。

總之，本研究闡明了廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與性別無(wú)關(guān)，與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān)。研究結(jié)果提供了廣西壯族人群骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)和rs9138位點(diǎn)SNP分布，并對(duì)比了不同國(guó)家或地區(qū)人群骨橋蛋白基因的SNP 差異，為與骨橋蛋白相關(guān)的疾病研究提供了參考資料，也為人類學(xué)和群體遺傳學(xué)補(bǔ)充了重要數(shù)據(jù)。

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