張 靜 呂 睿 呂永煥 宋學(xué)茹 趙曉徽 白曉紅

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心（300052）

自1983年世界上首例凍融胚胎移植（FET）獲得成功妊娠以來，凍融胚胎移植現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于人類輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。FET在預(yù)防嚴重卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生，提高累積妊娠率，減少多胎妊娠，減少多次促排卵給患者帶來的痛苦和減輕患者的經(jīng)濟負擔(dān)等方面具有重要意義。影響FET妊娠結(jié)局的因素很多，但如何提高FET的臨床妊娠率一直是生殖領(lǐng)域所關(guān)注的問題。玻璃化凍融胚胎技術(shù)與程序化技術(shù)相比操作簡便、冷凍復(fù)蘇效果好、胚胎植入率和臨床妊娠率高［1］。本研究通過回顧性分析本中心247個FET周期的臨床資料，探討FET妊娠結(jié)局的影響因素。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選取2013年1月～2014年1月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心接受FET的患者臨床資料，共計247個FET周期，患者年齡23～45（32.2±4.4）歲。

1.2 胚胎冷凍選擇標準

細胞數(shù)目發(fā)育正常［第2天（D2）發(fā)育到2～5細胞，第3天（D3）發(fā)育到7～9細胞］，卵裂球均勻或稍不均勻，碎片＜25%予以冷凍，在患者知情同意下少量非優(yōu)質(zhì)胚胎也予以冷凍。

1.3 胚胎玻璃化凍融方法

1.3.1 凍融液準備 冷凍A液（HS）：由杜氏磷酸緩沖液（DPBS）、20%人血清白蛋白（HAS）、10%二甲基亞砜（DMSO）、10%乙二醇（EG）構(gòu)成。冷凍B液（VS）：由 DPBS、20%HSA、20%DMSO、20%EG、0.4M蔗糖構(gòu)成。解凍液1：含1M蔗糖的DPBS。解凍液2：含0.25M 蔗糖的DPBS。解凍液3：含0.125M 的 DPBS。解凍液 4：含 20%HSA 的DPBS。

1.3.2 冷凍 冷凍載體選用日本加藤載桿。室溫下將1～3個胚胎放入HS中4min，平衡結(jié)束后將胚胎放在VS中輕輕吹吸數(shù)次，在30s內(nèi)將胚胎放在冷凍載體前端標記的位置，確認胚胎在載體上后迅速投入液氮，再在液氮內(nèi)完成裝桿過程。

1.3.3 解凍 從液氮中取出冷凍管，確認信息正確無誤后，將胚胎快速移入37℃解凍液1中5min，依次移入解凍液2中2～3min，解凍液3中1～2min，解凍液4中1min，胚胎存活后轉(zhuǎn)入含胚胎膠的移植皿中待移植。

1.4 內(nèi)膜準備

根據(jù)患者既往月經(jīng)周期和排卵情況選擇自然周期、人工周期或者促排卵周期進行子宮內(nèi)膜準備。①自然周期組：既往月經(jīng)規(guī)律有排卵者，B超檢測卵泡發(fā)育及內(nèi)膜厚度及形態(tài)，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑達到18mm時，可予以人絨毛膜促性腺激素（hCG）6000～8000U誘導(dǎo)排卵，B超監(jiān)測排卵日期，排卵后予以孕激素40～80mg／d促使子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，根據(jù)凍胚時間決定移植時間。②人工周期組：適用于月經(jīng)不規(guī)律，排卵障礙或既往監(jiān)測內(nèi)膜偏薄的患者。常用戊酸雌二醇3mg，每日2次，7d后B超檢測內(nèi)膜厚度及評價生長速度，根據(jù)情況調(diào)整用量，B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度6～8mm時予以孕激素40～80 mg／d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，根據(jù)凍胚時間決定移植時間。③促排卵周期組：適用于不排卵或者排卵不規(guī)律者，月經(jīng)第3天予以尿促性素（HMG）促排卵，適當(dāng)調(diào)整用量，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑達到18mm時，予以hCG誘發(fā)排卵，排卵后予以孕激素40～80mg／d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，根據(jù)凍胚時間決定移植時間。移植后繼續(xù)予以孕激素60～80mg／d黃體支持治療。本研究對于內(nèi)膜過厚（＞18mm）或者太薄（＜6.5mm）者，經(jīng)多方面評估取消此次周期。

1.5 移植胚胎數(shù)目

2013年上半年移植3個胚胎的共68例，為降低多胎的發(fā)生，下半年僅移植2個胚胎，對于既往冷凍≥3個的胚胎解凍后，在患者知情同意下選擇較好的2個移植，剩余的進行體外培養(yǎng)觀察，如有囊胚形成，再予以冷凍。

1.6 妊娠判斷

移植后2周測定尿和血β-hCG，移植后4周，B超檢查見妊娠囊確定為臨床妊娠。根據(jù)臨床妊娠結(jié)局分為妊娠組（112例）和非妊娠組（135例）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0進行l(wèi)ogistic多因素回歸分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，篩選出有統(tǒng)計學(xué)意義的因素，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

胚胎總復(fù)蘇率為96.5%（574／595），周期取消率為0（0／247）。妊娠組和非妊娠組胚胎復(fù)蘇率分別為97.7%（260／266）和95.4%（314／329），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。D2和D3胚胎復(fù)蘇率分別為94.0%（189／201）和97.2%（383／394），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。FET 臨床妊娠率為45.3%（112／247）。移植3枚、2枚和1枚胚胎的多胎率分別為40.0%（12／30）、31.3%（25／80）和0，其中3胎率分別為13.33%（4／30）和1.25%（1／80）。

2.2 妊娠結(jié)局影響因素的logistic多因素分析

移植日子宮內(nèi)膜厚度和凍胚時間與FET的妊娠結(jié)局有關(guān)。移植日子宮內(nèi)膜厚度3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)兩兩比較χ2檢驗內(nèi)膜厚度＞11.0mm的妊娠率高于其他兩組（P＜0.05），而內(nèi)膜厚度＜8.0mm 與8.0～11.0mm 者妊娠率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和表2。

表1 FET影響因素分析

表2 妊娠結(jié)局影響因素的logistic回歸分析

3 討論

3.1 子宮內(nèi)膜厚度與FET妊娠結(jié)局的關(guān)系

子宮內(nèi)膜的容受性即子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力，是特定時期的一種狀態(tài)，即著床窗口期，是FET能否獲得成功臨床妊娠的關(guān)鍵因素之一。胚胎著床必須具備的條件之一是胚胎與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育且功能協(xié)調(diào)。子宮內(nèi)膜厚度是評價子宮內(nèi)膜容受性的一項重要指標，然而子宮內(nèi)膜厚度的差異和FET妊娠結(jié)局的關(guān)系目前尚無統(tǒng)一觀點。有研究認為不同子宮內(nèi)膜厚度之間的臨床妊娠率無明顯差異［2］。而鄧朝暉等［3］的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜厚度＜8mm顯著低于≥8mm的種植率及臨床妊娠率。秘祖霞等［4］則研究發(fā)現(xiàn)FET日子宮內(nèi)膜厚度＞12.0mm與≤12.0mm相比胚胎著床率和臨床妊娠率更高。有學(xué)者則認為子宮內(nèi)膜厚度與妊娠率成正相關(guān)，隨著移植日子宮內(nèi)膜的增厚，妊娠率隨之提高［5］。而有研究認為胚胎著床需要適宜的子宮內(nèi)膜厚度，子宮內(nèi)膜太薄或者太厚均不利于胚胎著床，子宮內(nèi)膜厚度在8.0～11.0mm 內(nèi)妊娠率最高［6］，而宋夢玲等［7］研究發(fā)現(xiàn)FET日子宮內(nèi)膜厚度在9～14mm的臨床妊娠率最高。本研究數(shù)據(jù)則顯示移植日子宮內(nèi)膜厚度在6.5～18mm 范圍內(nèi)，＜8.0mm 和8.0～11.0mm與＞11.0mm相比均為＞11.0mm臨床妊娠率更高，而子宮內(nèi)膜厚度在8.0～11.0mm與＜8.0mm相比雖然臨床妊娠率有一定的提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此FET日子宮內(nèi)膜厚度＞11.0mm的妊娠率更高，提示子宮內(nèi)膜厚度是影響FET妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素，臨床上對子宮內(nèi)膜厚度的調(diào)控具有重要意義。

3.2 凍胚時間與FET妊娠結(jié)局的關(guān)系

目前大多數(shù)生殖中心都傾向于選擇D3進行胚胎移植或冷凍，從而期望能夠獲得更高的臨床妊娠率，但有時也需要根據(jù)具體情況選擇在D2移植和冷凍胚胎，然而D2胚胎和D3胚胎的復(fù)蘇率和妊娠率哪個更高觀點不一。有研究認為D2胚胎和D3胚胎的復(fù)蘇率、臨床妊娠率均無明顯差異［8］。而Salumets等［9］研究則認為D3胚胎比D2胚胎具有更高的復(fù)蘇率，但兩者的臨床妊娠率無明顯差異。唐永梅等［10］則發(fā)現(xiàn)D2胚胎比D3胚胎復(fù)蘇率和臨床妊娠率更高。有研究則認為D3胚胎與D2胚胎相比復(fù)蘇率較低但臨床妊娠率卻升高，這可能與D3胚胎正向桑椹期胚胎轉(zhuǎn)化，細胞代謝旺盛，細胞發(fā)生融合，冷凍耐受性差，而復(fù)蘇后存活的D3胚胎發(fā)育能力強，易于著床有關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示FET D3與D2胚胎的冷凍后復(fù)蘇率分別為94.0%和97%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但臨床妊娠率卻升高（59.7%和39.4%），與之前 Sifer等［12］的研究結(jié)果一致。D3胚胎多為7～9細胞，此時胚胎發(fā)育潛能高，著床能力強，而胚胎從4細胞到8細胞即D2到D3發(fā)育過程中可出現(xiàn)發(fā)育停滯或者質(zhì)量下降，可能與其在發(fā)育過程中啟動了異常淘汰和自我篩選的能力有關(guān)。因此如果患者的胚胎數(shù)目多、質(zhì)量高，則建議其等待胚胎發(fā)育到D3再移植和冷凍，使胚胎經(jīng)過發(fā)育停滯期，過濾掉那些低質(zhì)量的胚胎，篩選出高質(zhì)量的胚胎，從而提高臨床妊娠率。當(dāng)然如果患者的胚胎數(shù)目少或者質(zhì)量比較差，則建議其選擇D2胚胎移植或者冷凍，可以獲得一定數(shù)目的胚胎移植或者冷凍，從而避免在體外發(fā)育時間過長沒有優(yōu)質(zhì)胚胎，導(dǎo)致此周期無可移植的胚胎。

3.3 其他影響因素與FET妊娠結(jié)局的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示胚胎質(zhì)量、移植胚胎數(shù)目、孕婦年齡、子宮內(nèi)膜準備方案、受精方式和FET次數(shù)均與FET妊娠結(jié)局無關(guān)。較好的臨床妊娠結(jié)局是在保證臨床妊娠率的同時減少胚胎移植數(shù)目，從而降低多胎妊娠的發(fā)生，有研究認為移植胚胎數(shù)目以2個最為適宜［13］。本研究結(jié)果顯示移植1個、2個和3個胚胎的妊娠率比較無統(tǒng)計學(xué)差異，移植2個和3個胚胎的多胎妊娠率亦無統(tǒng)計學(xué)差異。移植2個胚胎可以最大程度地避免胚胎資源的浪費，增加胚胎冷凍的機會，從而提高累積妊娠率。移植3個胚胎時三胎率增加，若患者為三胎妊娠，則必須承受減胎所帶來的痛苦和風(fēng)險，因此本中心現(xiàn)以移植2個胚胎為標準。隨著輔助生殖技術(shù)的日益發(fā)展，胚胎種植率隨之提高，單胚胎冷凍和單胚胎移植成為一種趨勢。

3.4 多因素回歸分析

玻璃化FET的影響因素很多，在logistic多因素回歸分析中，移植日子宮內(nèi)膜厚度和凍胚時間起關(guān)鍵作用。因此為提高FET的妊娠率，臨床上對上述2個關(guān)鍵影響因素的調(diào)控具有重要意義，若患者的胚胎數(shù)量多，質(zhì)量高，則盡可能在第3天進行胚胎移植或冷凍，在一定子宮內(nèi)膜厚度范圍內(nèi)，選擇合適的時間（盡可能使子宮內(nèi)膜厚度達到11mm）轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜和胚胎移植。

玻璃化冷凍技術(shù)的復(fù)蘇率高，能更大程度地保持胚胎的發(fā)育潛能，是提高累積妊娠率的重要手段，為單胚胎移植和單胚胎冷凍提供了有力的技術(shù)支持。在胚胎冷凍和FET中，優(yōu)化和處理相關(guān)影響因素，更有助于提高玻璃化FET的妊娠率。

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