高雙全，肖高芳△，高雙榮，王林輝，丁 宇，杜日昌

（1.韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院病理科，廣東韶關(guān)512026；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100029）

三陰乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）表現(xiàn)為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子 受體 2（human epidermal growth factor receptor－2，Her－2）表達均缺失的一種特殊類型的乳腺癌［1］，占全部乳腺癌的13.7%～23.8%［2］，具有發(fā)病年齡輕、侵襲性高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存期短及預(yù)后差等特點，嚴重威脅了患者的生命。臨床上，TNBC對內(nèi)分泌治療不敏感，化療是目前惟一的全身性治療方法，但預(yù)后較差。因此尋求有效的治療方法已成為當(dāng)今研究的熱點。有研究表明，TNBC較非TNBC更容易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而增加腫瘤細胞的侵襲性和惡性程度，而Snail、糖原合成酶激酶3（GSK－3β）和E－鈣黏著蛋白（E－cadherin）均參與了EMT過程。因此，本文擬比較TNBC與非TNBC中Snail、GSK－3β和E－cadherin的表達的差異，對全面評價TNBC的預(yù)后具有重要意義，可能為TNBC的基因靶向治療提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院于2006年9月至2013年9月收治的48例TNBC患者作為觀察對象即TNBC組，隨機選出60例非TNBC患者作為對照即NTNBC組（ER、PR或HER－2為陽性），所有病例均有完整的臨床病理資料。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體Snail（Santa Cruz公司，美國）、E－cadherin（Abcam 公司，美國）。兔 抗人單克隆 抗 體GSK－3β（Santa Cruz公司，美國），免疫組織化學(xué)和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。GSK－3β抗體的工作濃度為1∶50，Snail與E－cadherin抗體的工作濃度為1∶100。

1.3 方法 石蠟包埋的乳腺癌組織標本，經(jīng)4μm連續(xù)切片后進行免疫組織化學(xué)染色。按SP法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書檢測乳腺癌樣本中GSK－3β、Snail和E－cadherin的表達。用已知的陽性片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 判斷標準 GSK－3β陽性結(jié)果為細胞質(zhì)染成棕黃色，陽性細胞數(shù)小于10%為陰性，≥10%為陽性。Snail主要定位于細胞核，其中陽性細胞數(shù)小于30%為陰性，≥30%為陽性。E－cadherin主要定位于細胞膜，陽性細胞數(shù)小于10%為陰性，≥10%為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料用率表示采用χ2檢驗分析，GSK－3β、Snail和 E－cadherin表達相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析；生存時間等預(yù)后指標用Kaplan－Meier法分析，用Log－Rank檢驗進行相關(guān)曲線的統(tǒng)計學(xué)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床指標比較與NTNBC組相比，TNBC組患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率升高（43.75%vs.25.00%），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NTNBC組和TNBC組患者腫瘤大小均以2.0～5.0cm多見，組織學(xué)類型均以浸潤性導(dǎo)管癌最常見，但兩組在患者年齡、腫瘤大小及組織學(xué)類型方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 TNBC組和NTNBC組患者的臨床病理因素比較［n（%）］

2.2 兩組患者 GSK－3β、Snail和 E－cadherin的表達情況比較 本研究結(jié)果顯示，TNBC組 GSK－3β的陽性表達率（54.17%）明顯高于 NTNBC組（25.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；TNBC組Snail的陽性表達率（43.75%）顯著高于NTNBC組（31.67%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNBC組E－cadherin的陽性表達率（22.92%）顯著低于 NTNBC組（46.67%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 兩組患者 GSK－3β、Snail和E－cadherin的表達情況比較［n（%）］

2.3 TNBC中GSK－3β表達與Snail和E－cadherin表達的相關(guān)性 48例TNBC組織中GSK－3β和Snail同時表達陽性16例（33.3%）；GSK－3β 和 Snail同時表達陰性15例（31.3%）。GSK－3β表達與Snail表達呈正相關(guān)（r＝0.296，P＜0.05）。48例TNBC組織中GSK－3β和E－cadherin同時表達陽性3例（6.3%）；GSK－3β和 E－cadherin同時表達陰性14例（29.2%）。GSK－3β表達與E－cadherin表達呈負相關(guān)（r＝－0.294，P＜0.05）。

A：GSK－3β在TNBC中的陽性表達；B：Snail在NTNBC中的陽性表達；C：E－cadherin在NTNBC中的陽性表達。

3 討 論

TNBC較NTNBC更容易發(fā)生EMT，使上皮細胞失去極性及與基底膜連接的上皮表型特征，從而獲得高遷移、侵襲及降解細胞外基質(zhì)的表型特征［3］。EMT的發(fā)生與多種蛋白分子有關(guān)。

E－cadherin是維持上皮表型的重要黏附分子，E－cadherin減少或缺失時，會導(dǎo)致腫瘤的過度增長和外向侵襲。有研究報道，E－cadherin表達陰性患者的預(yù)后明顯較陽性患者差［4］。E－cadherin的下調(diào)或缺失是發(fā)生EMT的重要標志［5］。增加E－cadherin表達、抑制Wnt通路可促進上皮分化并抑制EMT的過程［6］。本研究顯示，TNBC中E－cadherin較NTNBC表達明顯降低，在E－cadherin陰性的樣本中Snail、GSK－3β明顯增高，說明E－cadherin下調(diào)對TNBC低分化、高侵襲性發(fā)揮著重要作用。

GSK－3β是糖原合成酶激酶3的一個亞型，參與PI3－Kinase、Wnt/β－catenin及 Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和腫瘤發(fā)生等過程［7］，在細胞周期S期，GSK－3β水平最高，在凋亡早期，GSK－3β在細胞核內(nèi)迅速增加［8］。Wnt信號是參與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌浸潤行為的關(guān)鍵通路，GSK－3β在Wnt通路中與E－cadherin、Slug、β－連 環(huán) 蛋 白（β－catenin）共 同 參與了 EMT 過程［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC中GSK－3β表達較NTNBC明顯增高。因此，其是參與浸潤性乳腺癌的EMT過程中 Wnt/βcatenin信號通路的關(guān)鍵成分，GSK－3β持續(xù)高表達伴隨E－cadherin表達缺失與TNBC高侵襲性、低生存期密切相關(guān)。

Snail是近年發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是腫瘤細胞EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者［10］，其高表達和E－cadherin低表達，在腫瘤細胞浸潤、遷移過程中發(fā)揮著重要作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，Snail可作為乳腺癌的獨立負性診斷指標［12］，即Snail高表達，則乳腺癌分化差，侵襲性強，易轉(zhuǎn)移，生存期短。C?me等［13］發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Snail、Slug高表達能抑制E－cadherin啟動子，導(dǎo)致其部分表達或完全缺失，且Snail、Slug在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究顯示，TNBC中Snail較NTNBC中的表達水平明顯增高，在E－cadherin陰性表達樣本中的陽性表達率顯著高于E－cadherin陽性表達組，與C?me等［13］的結(jié)果一致，表明Snail表達與E－cadherin呈負相關(guān)，TNBC更具有強浸潤、遷移能力，并易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，TNBC中 GSK3β、Snail高表達、E－cadherin部分表達或完全缺如，與乳腺癌高侵襲性、易轉(zhuǎn)移、生存期短密切相關(guān)，聯(lián)合檢測 GSK3β、Snail、E－cadherin的表達，對判斷 TNBC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有重要的意義。

［1］Wang J，Xie X，Wang X，et al.Locoregional and distant recurrences after breast conserving therapy in patients with triple－negative breast cancer：A meta－analysis［J］.Surgical Oncology，2013，22（4）：247－255.

［2］林堅，胡梅齊，彭煒，等.三陰乳腺癌的臨床病理特征及預(yù)后［J］.中國癌癥雜志，2010，20（6）：462－465.

［3］SarrióD，Rodriguez－Pinilla SM，Hardisson D，et al.Epithelial－mesenchymal transition in breast cancer relates to the basal－like phenotype［J］.Cancer Res，2008，68（4）：989－997.

［4］Kashiwagi S，Yashiro M，Takashima T，et al.Significance of E－cadherin expression in triple－negative breast cancer［J］.Br J Cancer，2010，103（2）：249－255.

［5］Baranwal S，Alahari SK.Molecular mechanisms controlling E－cadherin expression in breast cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，384（1）：6－11.

［6］倪露露，李雁，任宏麗.Wnt信號通路和腫瘤干細胞在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中作用機制的研究述評［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（6）：1341－1344.

［7］Chen Y，Yue S，Xie L，et al.Dual Phosphorylation of suppressor of fused（Sufu）by PKA and GSK3beta regulates its stability and localization in the primary cilium［J］.J Biol Chem，2011，286（15）：13502－13511.

［8］曾益新.腫瘤學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：67－68.

［9］Prasad CP，Rath G，Mathur S，et al.Expression analysis of E－cadherin，Slug and GSK3beta in invasive ductal carcinoma of breast［J］.BMC Cancer，2009，9（3）：325－332.

［10］Batlle E，Sancho E，F(xiàn)ranci C，et al.The transcription factor Snail is a repressor of E－cadherin gene expression in epithelial tumour cells［J］.Nature Cell Biology，2000，2（2）：84－89.

［11］Becker KF，Rosivatz E，Blechschmidt K，et al.Analysis of the E－cadherin repressor Snail in primary human cancers［J］.Cells Tissues Organs，2007，185（1/2/3）：204－212.

［12］Muenst S，D?ster S，Obermann EC，et al.Nuclear expression of snail is an independent negative prognostic factor in human breast cancer［J］.Dis Markers，2013，35（5）：337－344.

［13］C?me C，Magnino F，Bibeau F，et al.Snail and slug play distinct roles during breast carcinoma progression［J］.Clin Cancer Res，2006，12（18）：5395－5402.