楊 勇，周 勇，曹 政，吳瑞霞，佟新竹，謝華強

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院：1.心血管內(nèi)科；2.腫瘤內(nèi)科 442000）

心肌肥大是老年患者充血性心力衰竭的重要病理生理過程之一，心肌肥大的過程包括心肌細胞體積的增大和蛋白合成的增加。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）主要與AngⅡ1型受體（AT1R）結(jié)合后激活心肌肥大的過程，AT1R過表達也與心肌肥大關(guān)系密切［1］。微小RNA（microRNA，miR）是一類19～25個堿基內(nèi)源性、具有高度保守性的非編碼RNA序列［2］。研究證實，多個 miR（miR－let－7a、miR－21、miR－22、miR－208、miR－206等）均參與了心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展過程的不同環(huán)節(jié)［3］。miR－155是一個多功能 miR，在肺、心臟及腎臟表達較豐富［4］。Blanco等［5］觀察到miR－155低表達與心肌肥大及心力衰竭的風險顯著升高相關(guān)；Zheng等［6］則發(fā)現(xiàn)miR－155能夠和細胞內(nèi)源性AT1RmRNA結(jié)合，抑制蛋白的翻譯，明顯降低AT1R的表達水平。心肌細胞有豐富的AT1R的表達，且在嚙齒類動物的心臟組織主要分布和表達的為AT1R的α亞型（ATR1α）［7］。因此本研究推測 miR－155可能通過對心肌細胞ATR1α表達的調(diào)控進而調(diào)節(jié)心肌肥大的發(fā)生。本研究擬觀察miR－155表達對大鼠心肌細胞肥大的影響以及對ATR1α表達的影響，以探討miR－155作為心肌細胞肥大的調(diào)控靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞株H9C2（2－1）由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國）、mirVana PARISTM Kit（Ambion公司，美國）由王漢琴博士惠贈；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；Platinum SYBRGreen qPCR SuperMix－UDG（Invitrogen Biotechnology中國公司）。AngⅡ（Sigma，美國）、兔抗 ATR1α多克隆抗體（ABCAM公司，英國）；兔抗CaN－β多克隆抗體、兔抗 NFATc－4抗體、兔抗β－actin多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體（Bioworld Technology公司，美國）；miR－155RNA 模擬物（mimics）及抑制物（inhibitors）由上海市吉瑪生物科技有限公司根據(jù)sanger miRNA數(shù) 據(jù) 庫 的 miR－155序 列 5′－UUA AUG CUA AUU GUG AUA GGG GU－3′（編號：MIMAT 0030409）設(shè)計并合成miR－155mimics，上游序列為：5′－UUA AUG CUA AUU GUG AUA GGG GU－3′，下 游 序 列 為：5′－CCC UAU CAC AAU UAG CAU UAA UU－3′。miR－155inhibitors序列為5′－ACC CCU AUCA CAA UUA GCA UUA A－3′。

表1 miR－155和U6內(nèi)參的RT及PCR引物序列

表2 RT－PCR各產(chǎn)物的引物序列

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng)及實驗分組 轉(zhuǎn)染 miR－155mimics及inhibitors的心肌細胞在轉(zhuǎn)染后24h加入1×10－7mol/L AngⅡ，繼續(xù)作用48h后用于后續(xù)檢測。實驗分對照組，不加任何藥物；AngⅡ組，加入 AngⅡ，終濃度為1×10－7mol/L，不進行轉(zhuǎn)染；模擬物組，轉(zhuǎn)染入 miR－155mimics 80nmol/L，miR－155抑制物組，轉(zhuǎn)染入 miR－155inhibitor 80nmol/L；AngⅡ加模擬物組，轉(zhuǎn)染入 miR－155mimics 80nmol/L并加入 AngⅡ，終濃度為1×10－7mol/L；AngⅡ加抑制物組，轉(zhuǎn)染入 miR－155inhibitor 80nmol/L并加入 AngⅡ，終濃度為1×10－7mol/L。

1.2.2 心肌細胞轉(zhuǎn)染、熒光檢測 心肌細胞用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)生長至融合后進行傳代，用含10% 胎牛血清的DMEM調(diào)節(jié)細胞密度至1×108/L種細胞于6孔板中。培養(yǎng)心肌細胞生長48h至細胞融合達30%～50%后，換無血清培養(yǎng)液并使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR－155mimics及inhibitors進入心肌細胞。激光共聚焦顯微鏡下使用藍色激光激發(fā)FAM熒光（激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長520nm），拍攝熒光圖片和同一視野中明場細胞照片。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測心肌細胞 miR－155的表達 收集對照組、模擬物組、miR－155抑制物組細胞，按照mir－Vana PARISTM試劑盒說明書提取并分離小于100nt的小分子RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用ABI 7300Real Time PCR System在48孔PCR反應(yīng)模塊中進行定量PCR檢測miR－155表達水平，反應(yīng)體系于50℃2min，95℃2min，95℃15s，然后60℃30s，共40次循環(huán)，最后20℃2min。以U6基因為內(nèi)標基因，使用2－ΔΔCT法計算 miR－155表達量。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR引物序列見表1。

1.2.4 細胞表面積檢測 轉(zhuǎn)染24h后，心肌細胞加AngⅡ繼續(xù)作用48h，取有心肌細胞生長的蓋玻片，用預(yù)冷的Hank′s液漂洗血清及雜質(zhì)，再用4%多聚甲醛固定15min后晾干。在相差顯微鏡下拍照，采用Leica圖像分析系統(tǒng)對心肌細胞進行計數(shù)并測量單個細胞直徑，每孔取10個視野，每個視野約20個細胞。測量細胞表面積，取平均值。每組重復(fù)3次。

1.2.5 RT－PCR 法檢測心肌肥大標記物 ANP、β－MHC 及ATR1αmRNA表達 細胞處理后，依據(jù)產(chǎn)品說明書用Trizol裂解；氯仿抽提；4℃，15 000r/min離心15min，上層無色液相用異丙醇沉淀，加入DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度計測定A衡量純度（適當比值在1.6～2.0）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）合成模板cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)后取PCR產(chǎn)物5μL在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀進行分析，結(jié)果以吸光度比值表示。各產(chǎn)物的PCR引物序列、片段長度、退火溫度見表2。PCR 反應(yīng)條件為 94 ℃、3min，94 ℃、30s，72℃、1min，循環(huán)35次，最后72℃ 延伸10min。

1.2.6 Westen bolt法檢測心肌細胞的ATR1α表達 提取心肌細胞總蛋白，4，4－二羧基酸－2，2－二喹啉（BCA）法測定蛋白濃度，完畢后將其加入5%十二烷基環(huán)酸鈉（SDS）加樣緩沖液中煮沸5min，以使蛋白質(zhì)樣品變性，置于－80℃凍存?zhèn)溆谩０疵靠咨蠘恿?0μg進行SDS－PAGE電泳，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，一抗孵育4℃過夜（ATR1α1∶500），TBST 洗滌后加入熒光的山羊抗兔IgG（1∶15 000）室溫孵育1h，采用化學(xué)發(fā)光法于暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。將膠片進行掃描存檔，Bio－Bad公司Quantity－One軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。蛋白表達量用目的蛋白/GAPDH的吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 每組進行獨立重復(fù)3次試驗，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組之間比較使用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，后以Tukey′s post－test進行檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細胞miR－155模擬物轉(zhuǎn)染與miR－155表達水平 轉(zhuǎn)染24h后，在激光共聚焦顯微鏡的藍光激發(fā)狀態(tài)下，可見綠色熒光在視野下成簇分布（圖1B）。與同一視野下明場細胞照片（圖1A）進行融合后發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要分布在細胞質(zhì)中（圖1C）。證實miR－155模擬物通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法成功轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。實時熒光定量PCR顯示，與AngⅡ組對比，AngⅡ加模擬物組心肌細胞miR－155水平明顯升高達3～4倍［（3.58±0.06）vs.（1.00±0.02），P＜0.05］；AngⅡ加抑制物組心肌細胞 miR－155水平下降［（0.46±0.01）vs.（1.00±0.02），P＜0.05］。

圖1 轉(zhuǎn)染后心肌細胞熒光分布（熒光顯微鏡×400）

圖2 各組心肌細胞圖片（×200）

2.2 心肌細胞表面積改變與對照組相比，在AngⅡ作用下，AngⅡ組心肌細胞表面積出現(xiàn)擴大（P＜0.05）；而模擬物組與抑制物組，心肌細胞表面積僅有增加趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與AngⅡ組比較，轉(zhuǎn)染 miR－155模擬物及 miR－155抑制物入心肌細胞后再給予刺激，AngⅡ加模擬物組心肌細胞表面積明顯縮?。≒＜0.05），見圖2和圖3。

圖3 各組心肌細胞表面積比較

2.3 ATR1αmRNA和蛋白表達與對照組相比，模擬物組和miR－155抑制物組的ATR1αmRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與AngⅡ組對比，AngⅡ加模擬物組心肌細胞ATR1αmRNA和蛋白表達水平均下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞ATR1αmRNA和蛋白表達比較

2.4 心肌肥大標記物β－MHC及ANP mRNA表達與對照組相比，模擬物組和miR－155抑制物組的β－MHC mRNA表達水平無明顯增加（P＞0.05）；與AngⅡ組相比，AngⅡ加模擬物組的β－MHC表達明顯減少（P＜0.05）見圖5、6。與對照組相比，模擬物組和miR－155抑制物組的ANP mRNA表達水平無明顯增加（P＞0.05）；與AngⅡ組相比，AngⅡ加模擬物組的 ANP mRNA表達明顯減少（P＜0.05）見圖7、8。

圖5 各組細胞β－MHC與GAPDH PCR條帶密度比較

圖6 各組細胞β－MHC相對表達量分析圖

圖7 各組細胞ANP與GAPDH PCR條帶密度比較

圖8 各組細胞ANP相對表達量分析圖

3 討 論

miR是一類內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達或翻譯，可在不同生理和病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)心肌細胞的增殖、分化及凋亡，對機械重塑、心電重塑均有重要影響［8］。本研究使用實時熒光定量PCR方法成功檢測出體外培養(yǎng)心肌細胞株的 miR－155表達；而在 miR－155 mimics轉(zhuǎn)入心肌細胞后可明顯觀察到miR－155表達增加到基礎(chǔ)水平的3～4倍，而miR－155inhibitors可有效抑制miR－155表達；提示使用miR－155合成物可成功調(diào)節(jié)細胞內(nèi)miR－155的表達水平，為進一步研究miR－155對細胞的影響提供了條件。

miR－155過表達能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細胞表面的ATR1α基因和蛋白的表達，心肌肥厚的相關(guān)基因ANP、β－MHC的表達明顯減少，心肌細胞表面積也明顯減少，提示miR－155過表達可能通過下調(diào)ATR1α表達進而達到改善心肌肥大的作用。Cheng等［9］通過miR－155過表達干預(yù)嚴重子癇患者的體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞，觀察到miR－155過表達可明顯下調(diào)AT1R基因和蛋白水平的表達；這與本研究觀察結(jié)果是相似的。研究還發(fā)現(xiàn)，對于未給以AngⅡ刺激誘導(dǎo)的肥厚心肌細胞，miR－155過表達或者抑制表達均未表現(xiàn)出對ATR1α顯著的調(diào)節(jié)作用，也未表現(xiàn)出顯著的改變心肌細胞肥大標記物β－MHC、ANP表達及改變心肌細胞表面積的作用，提示miR－155對正常心肌細胞和肥大心肌細胞ATR1α、β－MHC、ANP基因的調(diào)控具有時間分布的差異。Lunde等［10］使用miR基因芯片方法檢測主動脈縮窄心肌肥厚大鼠模型心肌中miR表達時發(fā)現(xiàn)在主動脈縮窄造模后的1～14d均不能檢測出miR－155表達，在14d后心肌肥厚程度較明顯時才能檢測到miR－155表達，與本研究的推測一致；提示miR－155主要在心肌肥大的晚期調(diào)控中發(fā)揮作用。

Heymans等［11］、Seok等［12］發(fā)現(xiàn) miR－155過表達可通過多種途徑促進心肌肥大和心力衰竭發(fā)生，沉默miR－155則改善心肌肥大，與本研究的結(jié)果不一致。分析可能與miR對細胞功能的調(diào)節(jié)過程往往涉及多個信號通路，且多個miR參與其中，miR之間也存在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其調(diào)節(jié)受到多因素的調(diào)控［13］；而動物模型的差異導(dǎo)致不同信號通路的激活不同，得到不一致的結(jié)果，本研究組擬進一步在不同心肌肥厚的動物模型中驗證miR－155對心肌肥厚的具體作用及探討其涉及的調(diào)節(jié)通路。因此，通過本研究可證實miR－155能夠有效抑制ATR1α基因和蛋白水平的表達，抑制由AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥大。因此miR－155可作為高血壓心肌肥大的調(diào)控靶點進一步進行深入的研究。

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