姚 杰，孫 軍，寧 波

(安徽省兒童醫(yī)院骨科，安徽合肥 230051)

侵襲性纖維瘤病，被認為來源于間充質(zhì)病變的面部、腱膜或肌肉結(jié)締組織。該腫瘤的特征是浸潤性生長，高復發(fā)率，但無遠處轉(zhuǎn)移［1]。侵襲性纖維瘤病是侵襲性生長，但發(fā)病罕見，約為每萬人2～4人的發(fā)病率［2－3]。相較于成人侵襲性纖維瘤病，小兒侵襲性纖維瘤病具有鮮明的特點。小兒侵襲性纖維瘤病的復發(fā)率達75%，遠高于成年人［4－5]。兒童侵襲性纖維瘤病是目前一個熱點的研究領(lǐng)域。然而，該疾病的病因和發(fā)病機制仍不清楚。

β-catenin作為Wnt信號通路的核心蛋白，其表達量發(fā)生改變會直接引起一系列下游蛋白表達的改變，從而引起腫瘤樣病變的發(fā)生［5]。近期研究表明侵襲性纖維瘤病中β-catenin的3號外顯子確定存在突變。然而，到目前為止，研究兒童3號外顯子突變的很少。因此，本研究的目的是調(diào)查在兒童侵襲性纖維瘤病β-catenin的表達和3號外顯子的突變狀態(tài)。

1 資料和方法

1．1 資料 選取安徽省兒童醫(yī)院在2007年6月至2013年5月間因下肢或臀部接受手術(shù)的侵襲性纖維瘤病患兒32例，男13例，女19例，年齡3～15歲(平均8歲)。32例中，有21例復發(fā)。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診，并由高年資的病理醫(yī)生審查了所有切片。沒有患者被診斷為Gardner綜合征和家族遺傳腺瘤性息肉病(familial adenomatouspolyposis，nFAP)。另有15例與β-catenin基因表達無關(guān)的病變(其中3例肌纖維瘤，8例瘢痕組織，2例淺表纖維瘤病，1例脂肪瘤和1例骨肉瘤)作為對照。

1．2 免疫組化 所有石蠟標本切片，將切片在56℃環(huán)境下干燥，二甲苯脫蠟，水化，并在室溫下用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，每次5 min。3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min。切片經(jīng)20 min微波處理，在10 mmol·L－1檸檬酸鈉(pH 6．0)中進行抗原修復。切片在封閉液中(包含5%脫脂牛奶的PBS)在室溫下培育5 min抑制非特異性抗體的結(jié)合。然后除陰性對照外，將切片用抗βcatenin抗體(ab2365，Abcam 公司，1∶125 稀釋)在4℃冰箱孵育過夜。用PBS洗滌3次后，將切片過氧化物酶結(jié)合的AffiniPure山羊免疫球蛋白(1∶1200 0稀釋)1 h。為了顯現(xiàn)結(jié)合的抗體，切片與3，3-9-氨基聯(lián)苯胺處理。最后將切片用Mayer氏蘇木素染色。

以半定量的方法分析免疫組織化學的結(jié)果，每個切片隨機選取5個區(qū)域統(tǒng)計每單位面積的腫瘤細胞的數(shù)量。使用40倍鏡片對β-catenin陽性的腫瘤細胞所占百分率進行評估。結(jié)果基于以下標準:(1)陰性:腫瘤細胞的陽性染色率為10%;(2)弱陽性:10%～50%的腫瘤細胞染色為陽性;(3)陽性:腫瘤細胞的陽性染色大于50%。免疫組化染色半定量使用Image Pro Plus軟件進行分析

1．3 DNA提取和直接DNA序列分析 對石蠟包埋的組織進行切片(各10μm厚)。使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(QIAGEN公司，瓦倫西亞，CA，USA)進行DNA基因組提取。DNA濃度使用設(shè)定在260 nm的波長分光光度計測定。

β-catenin外顯子3通過聚合酶鏈反應(PCR)用下面的引物擴增:Forward，5－ATGGAACCAGACAGAAAAGC －3;Reverse，5－GCTACTTGTTCTTGAGTGAAG－3。PCR反應在Eppendorf溫度循環(huán)器按照以下循環(huán)條件進行:35個循環(huán)的94℃30 s，56℃45 s，72℃60 s，接著72℃最后延伸10 min。所得201堿基對使用QIAquick PCR純化試劑盒純化。測序反應在ABI(3730)遺傳分析儀進行，并進行直接測序。僅包含水的反應物用作陰性對照。使用美國國家生物技術(shù)信息中心BLAST比對工具的結(jié)果進行分析。

1．4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)使用標準差分析。使用統(tǒng)計軟件(SPSS16．0)進行統(tǒng)計學分析。兩組定量數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗。兩組定性數(shù)據(jù)的比較采用Fisher精確確切概率法。P＜0．05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 β-catenin在小兒侵襲性纖維瘤病的表達 在32例侵襲性纖維瘤病樣本中觀察到30例中β-catenin在細胞核中染色陽性，其余2例則在胞質(zhì)中染色。在對照組中，有2例表現(xiàn)出弱陽性β-catenin染色，余數(shù)為陰性。在侵襲性纖維瘤病β-catenin的表達較對照組顯著增強(P＜0．001)。通過IOD計算β-catenin表達的半定量分析證實侵襲性纖維瘤病組的β-catenin表達強于對照組，見圖1。

2．2 侵襲性纖維瘤病β-catenin的3號外顯子3基因突變檢測結(jié)果 32例侵襲性纖維瘤病中β-catenin基因的3號外顯子突變存在于25例(78%)中，其中21例復發(fā)病例中有19例(90%)出現(xiàn)，11例初發(fā)病例中有6例出現(xiàn)(55%)。在復發(fā)病例中3號外顯子的突變明顯高于初發(fā)病例(P=0．032)。對兩個不同突變位點進行分析鑒定，即2個不同的密碼子(41和45號密碼子)。41號密碼子中的突變是從ACC到GCC(圖2)，從而導致丙氨酸置換為蘇氨酸(Thr)(T41A)，并在25例(20%)樣品中檢測到5例。45號密碼子中的突變從TCT至TTT(圖2)，從而導致苯丙氨酸被取代為絲氨酸(絲氨酸)(S45F)，并在25例(80%)樣品發(fā)現(xiàn)20例。在所有的復發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)的突變均位于45位密碼子(S45F)，而初發(fā)病例中僅有1例 S45F的突變(P=0．002)。所有初發(fā)病例的突變位點位于41號密碼子(T41A)。對照組中沒有檢測出基因突變。

3 討論

β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路的核心蛋白，Wnt信號通路的激活主要通過激活β-catenin來完成的［5－6]。同時，Wnt信號通路的 β-catenin 在細胞黏附中的作用已被很好闡述［6–8]。β-catenin 的失調(diào)可通過多種途徑導致異?；虮磉_和信號的改變。突變在β-catenin表達的失調(diào)方面發(fā)揮重要作用，并可能導致蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，使其在細胞質(zhì)中積累并被運輸?shù)郊毎酥?，這種改變多導致細胞增殖能力的增加，最終會導致腫瘤的發(fā)生或腫瘤侵襲性增加［10]。重要的是，β-catenin已被證實可以與E－鈣黏蛋白的結(jié)合，在細胞黏附中發(fā)揮重要作用［8－9，11]。鈣黏蛋白介導的細胞黏附可以抑制癌細胞的侵襲性。因此，β-catenin表達的增強可能導致腫瘤侵襲性的增強［11－12]。侵襲性纖維瘤的發(fā)病及高復發(fā)率的分子生物學原因仍然不清楚，但β-catenin在成年侵襲性纖維瘤病的核表達在許多以前的研究［13－14]已經(jīng)描述和發(fā)生率超過90%。然而，很少有研究檢測探討兒童β-catenin的表達及基因突變與該腫瘤的發(fā)生和復發(fā)的關(guān)系

一項研究報道表明，90%的兒童侵襲性纖維瘤病表現(xiàn)出β-catenin的核表達，類似于本研究的結(jié)果［15]。相比之下，Thway 等［16]有另一項研究發(fā)現(xiàn)只有42%(21/50)的小兒侵襲性纖維瘤病病例有β-catenin的核表達。這些結(jié)果的不同可能是因為腫瘤的發(fā)病位置不同而造成的。在本研究中，侵襲性纖維瘤全部發(fā)生在臀部或下肢。小兒侵襲性纖維瘤病β-catenin的高表達可能是因為兒童相比成年人有較高的復發(fā)率。本研究的結(jié)果表明患者所有樣本的β-catenin的基因突變率為78%。這些發(fā)現(xiàn)也證實了以前在成人患者的研究的結(jié)果。侵襲性纖維瘤病的高突變率表明β-catenin突變可能是在這種腫瘤中普遍存在的。

在本研究中，侵襲性纖維瘤病β-catenin有強陽性的核表達。先前的研究已經(jīng)表明，β-catenin的細胞核表達具有診斷和預后價值［13，17－18]。重要的是，它往往很難從幾個相關(guān)的疾病，包括瘢痕組織，淺表纖維瘤病和反應性成纖維細胞增殖區(qū)分侵襲性纖維瘤病。然而，我們的研究結(jié)果表明，小兒侵襲性纖維瘤病β-catenin突變發(fā)生在大多數(shù)病例中。因此，在β-catenin的3號外顯子突變可以用于侵襲性纖維瘤病的基因?qū)W診斷。

雖然β-catenin的3號外顯子突變先前已在侵襲性纖維瘤?。?9]中有所描述，本研究是少數(shù)特異性檢測兒童侵襲性纖維瘤3號外顯子的點突變的研究。事實上，在這項研究中觀察到的3號外顯子突變頻率(78%總體，90%為復發(fā)病例)明顯高于以前的研究中觀察到的成人病例［19－20]。在這些兒童患者只有2個外顯子點檢測到突變分別是3-S45F和T41A。S45F突變只發(fā)生在復發(fā)病例，因此對T41A突變和S45F突變進行分析，S45F突變在復發(fā)病例中更有意義(P=0．002)。一項研究在42例侵襲性纖維瘤中發(fā)現(xiàn)有27例中的CTNNB1的3號外顯子突變(64%)，3個突變被鑒定:T41A(63%)，S45F(30%)和S45P(7%)［15]。這項研究并沒有討論突變和復發(fā)病例之間的關(guān)系。在我們的研究中，觀察到T41A和S45F突變，而沒有檢測到S45P。我們推測該差異可能是由種族差異或年齡等因素所引起。

根據(jù)我們的經(jīng)驗，侵襲性纖維瘤病的病程顯然是不確定的。雖然有些腫瘤手術(shù)后不復發(fā)，但多數(shù)腫瘤還是表現(xiàn)出了完全切除后局部復發(fā)趨勢。這種顯著差異表明分析分子改變可用于預測該腫瘤預后的可能性。作為本研究的結(jié)果，我們認為3號外顯子S45F突變可以作為一個不良預后因素。本研究中這種突變在兒科病例出現(xiàn)較成人病例以前的研究更頻繁。因此，侵襲性纖維瘤病的患兒復發(fā)率較成年人高可能是兒童S45F突變的頻率較高。

結(jié)合早期的研究，我們的研究結(jié)果表明，βcatenin的異位表達在侵襲性纖維瘤病中起重要作用。此外，從本研究的結(jié)果還表明，對β-catenin的3號外顯子的突變狀態(tài)分析可用于預測小兒患者復發(fā)的風險，但仍需進一步的研究和隨訪S45F突變，β-catenin的表達，腫瘤復發(fā)之間的關(guān)系。

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