任 強 丁玉蓮 王亞楠 陳 迪 付英杰 王建安

（濟寧醫(yī)學院藥學院，山東 日照276826）

洋蔥（Allium Cepa Linn）為百合科（Liliaceae）蔥屬，兩年生草本植物，又稱蔥頭、圓蔥。藥理研究表明洋蔥具有消炎抑菌、抗癌、抗血小板凝聚、降血糖、降血脂和膽固醇、抗氧化等多種藥理作用［1－5］。目前，對洋蔥中黃酮類化學成分定量分析的研究較少［6－9］。

黃酮類化合物是植物中分布非常廣泛的一類天然產(chǎn)物，具有特征紫外吸收光譜，在250～265nm和345～355nm有最大紫外吸收［10］。洋蔥是黃酮類化合物含量較高的蔬菜之一，其中黃酮類化合物主要是黃酮醇及其苷類，主要包括槲皮素、山奈酚、槲皮素－4′－葡萄糖苷、槲皮素－3－葡萄糖苷、楊梅 黃 酮、桑 色 素 等［7，9］。 本 文 擬 采 用 HPLCDAD方法，以蘆丁為對照品，對其中主要的黃酮類化學成分進行定量分析，為進一步合理食用以及洋蔥加工品的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與實驗材料

1．1 儀器

高效液相色譜儀為Shimadzu LC－20AT，配有雙泵；SIL－20A 自 動 進 樣 器；CTI－20AC 柱 溫 箱；SPD－M20A檢測器；LC solution數(shù)據(jù)處理工作站；Shimadzu VP－ODS（250mm ×4．6mm，5μm）色譜柱；電子天平（準確至千分之一，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ－500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；溶劑過濾器（天津津騰公司）；循環(huán)水真空泵（鄭州科創(chuàng)儀器有限公司）。

1．2 實驗材料

蘆?。ㄅ枺篗UST－13040302）北京恒元啟天化工技術研究院＆北京世紀奧科生物技術有限公司；乙腈，色譜級，購于Burdick ＆Jackson公司；水，去離子水，購于杭州娃哈哈公司；圓蔥購買日照大潤發(fā)超市。

2 方法與結果

2．1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品各約10．05mg，置于10 ml容量瓶中，加80%乙醇溶液使溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，得到約1．005mg／ml的對照品儲備液。用80%乙醇溶液按一定比例稀釋，得到系列濃度的對照品標準曲線溶液（5．0μg／ml、10．0μg／ml、50．2μg／ml、100．5μg／ml、251．2μg／ml、502．5 μg／ml）。

2．2 供試品溶液的制備

取洋蔥1．0g，精密稱定，置具塞圓底玻璃試管中，精密加入80%乙醇5ml，密塞，稱定重量。室溫浸泡15min后，超聲提?。üβ?00W，頻率40 kHz）30min，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，用0．45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2．3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

Shimadzu VP－ODS （250mm × 4．6mm，5 μm）色譜柱；流動相A為水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為0～20min 5%～95%B，20～21min 95%～5%B，21～25min 5%B；流速1ml／min；柱溫30°C；檢測波長為350nm；進樣量20μL，上述色譜條件下，分析對照品和樣品。對照品蘆丁和洋蔥樣品色譜圖分別見圖1和2。

圖1 對照品蘆丁的色譜圖

圖2 樣品的色譜圖及4個主要黃酮類化合物的紫外光譜圖

2．4 含量測定方法學驗證

2．4．1 線性關系考察 將系列濃度的標準曲線樣品 溶 液 （5．0μg／ml、10．0μg／ml、50．2μg／ml、100．5μg／ml、251．2μg／ml、502．5μg／ml），按 照“2．3項下”，從低濃度到高濃度連續(xù)進樣，以被測物濃度（X）為橫坐標，被測物的峰面積（Y）為縱坐標，按最小二乘法進行標準曲線的擬合，得標準曲線線性回歸方程和線性相關系數(shù)r值。得到蘆丁的回歸方程Y＝12155X－58108，線性相關系數(shù)r均大于0．9995。

2．4．2 精密度試驗 通過測定日內(nèi)及日間質(zhì)控樣品（蘆丁對照品溶液）的峰面積相對標準偏差（RSD）來驗證方法的精密度，日內(nèi)精密度要求同一日內(nèi)低、中、高3種濃度水平（10μg／ml、50μg／ml、250μg／ml）的質(zhì)控樣品連續(xù)測定6次；日間精密度要求低、中、高3種濃度水平的質(zhì)控樣品連續(xù)測定6d，每天測定1次。結果日內(nèi)精密度RSD小于2．1%，日間精密度RSD小于3．3%，表明儀器的精密度良好，可以滿足含量測定的要求。

2．4．3 重復性試驗 稱取同一份洋蔥樣品6份，按照“2．2項下”方法制備供試品溶液，按照“2．3項下”進行測定，以洋蔥樣品色譜圖中4個黃酮類化學成分峰面積計算，4個黃酮類的精密度RSD值小于4．1%，表明該方法的重復性符合含量測定的要求。

2．4．4 穩(wěn)定性試驗 將洋蔥樣品，按照“2．2項下”方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24h按照“2．3項下”測定，以洋蔥樣品色譜圖中4個黃酮類化學成分峰面積計算，結果RSD均小于2．7%，表明供試品溶液在室溫放置24h穩(wěn)定性。

2．4．5 回收率試驗 稱取洋蔥樣品9份，每份各1．0g，分別精密加入蘆丁對照品溶液（10μg／ml、50 μg／ml、250μg／ml）各5mL，每個濃度制備3份，置于通風櫥下，待溶液揮干，按照“2．2項下”供試品溶液制備方法處理后，進行 HPLC－DAD分析，帶入標準曲線，結果顯示，3個濃度的回收率在95．1%～103．2%范圍內(nèi)，RSD小于3．7%，表明該方法能夠較好的對黃酮類成分進行含量測定準確度較高。

2．4．6 最 低 檢 測 限 （LLOD）和 最 低 定 量 限（LLOQ） 取標準曲線的最低濃度（5．0μg／ml）標準曲線工作溶液，用80%乙醇逐級稀釋，進行HPLC－DAD分析，記錄信號強度與噪音的比值，信噪比S／N≥3時的溶液濃度確定為LLOD，S／N≥10時的溶液濃度確定為LLOQ。結果該方法的最低檢測限為0．3μg／ml，最低定量限為1．0μg／ml。

2．5 樣品測定

取洋蔥樣品3份，按照“2．2項下”方法制備供試品溶液，按照“2．3項下”HPLC－DAD分析方法，將峰面積值帶入相應的線性回歸方程計算濃度，結果洋蔥中4個主要的黃酮類化學成分的含量約為2．8mg／g。

3 討論

本實驗分別采用甲醇－水和乙腈－水，進行等度洗脫和梯度洗脫，對流動相和洗脫方式進行篩選和優(yōu)化，結果表明，在乙腈－水的流動相中梯度洗脫，4個黃酮類化學成分的色譜峰的峰形和分離度均優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)。因此，選擇乙腈－水水作為流動相。黃酮類化學成分的極性相對較大，供試品溶液的制備過程中，采用80%乙醇溶液，提取效率較高。而提取方式方面，超聲提取方法比加熱回流提取方法更為方便，所以采用超聲提取。一般總黃酮的含量測定，多采用分光光度法，以蘆丁為對照品，但存在其他具有紫外吸收化學成分的干擾，影響含量測定結果的準確性，同時也不能提供黃酮種類的信息。本實驗首先通過色譜分離，使各個化學成分獲得較好的分離，而后通過二極管陣列檢測器獲得化學成分的紫外光譜圖，推測其中的黃酮類成分，而后以蘆丁為對照品，對其中的總黃酮進行定量分析，結果比較準確，能夠提供洋蔥中黃酮的種類信息。如果與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用，還可以初步推測其中可能黃酮類化學成分的結構式。

本實驗建立的方法操作簡便，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、精確度和重現(xiàn)性，能夠較好的測定洋蔥中總黃酮的含量，為進一步合理食用以及洋蔥加工品的質(zhì)量控制提供參考。

［1］ 馮長根，吳悟賢，劉霞，等 ．洋蔥的化學成分及藥理作用研究進展［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2003，37（7）：63－64．

［2］ 劉良科，趙麗娟．洋蔥生物活性物質(zhì)的研究進展［J］．懷化學院學報，2009，28（5）：55－58．

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［10］Ren Q，Wu C S，Ren Y，et al．Characterization and identification of the chemical constituents from tartary buckwheat（Fagopyrum tataricum Gaertn）by high performance liquid chromatography／photodiode array detector／linear ion trap FTICR hybrid mass spectrometry［J］．Food Chemistry，2013，136（3－4）1377－1389．