姜穎，于英君，劉國良，齊彥，李紅影，孫力( 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱50040;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院)

猴頭多糖對(duì)小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及機(jī)制探討

姜穎1，于英君1，劉國良2，齊彥1，李紅影1，孫力1
( 1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150040;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院)

摘要:目的觀察猴頭多糖對(duì)小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，并從細(xì)胞凋亡角度探討其作用機(jī)制。方法將50只小鼠腋下皮下注射S180肉瘤細(xì)胞，制作腫瘤移植模型。造模成功后隨機(jī)分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環(huán)磷酰胺組各10只，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別予猴頭多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干預(yù)10 d;模型組予生理鹽水0.2 mL/d灌胃，連續(xù)10 d;環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺40 mg/kg腹腔注射，1次/d，共干預(yù)5 d。于第10天處死各組小鼠，計(jì)算抑瘤率，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，免疫組化法檢測(cè)Caspase-3蛋白。結(jié)果低劑量組、中劑量組、高劑量組、環(huán)磷酰胺組抑瘤率分別為36.36%、57.57%、43.93%、74.24%，環(huán)磷酰胺組抑瘤率明顯高于其余各組，中劑量組抑瘤率高于低劑量組、高劑量組，P均＜0.05;凋亡細(xì)胞數(shù)及Caspase-3蛋白表達(dá)為環(huán)磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組，P均＜0.05。結(jié)論猴頭多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生長，以50 mg/kg劑量作用最佳;該作用與其增加Caspase-3蛋白表達(dá)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞:猴頭多糖;肉瘤;細(xì)胞凋亡;凋亡相關(guān)蛋白

Inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on mice subcutaneous transplanted sarcoma and its mechanism

JIANG Ying1，YU Ying-jun，LIU Guo-liang，QI Yan，LI Hong-ying，SUN Li
( 1 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Abstract:Objective To observe the inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on the mice subcutaneous transplanted sarcoma，and to explore its mechanism from apoptosis perspective.Methods S180 sarcoma cells were subcutaneously injected into 50 mice to produce the models of subcutaneous tumor transplantation.After successful modeling，the tumor bearing mice were randomly divided into five groups，10 in each group: the low-dose group，medium-dose group，high-dose group，model group and cyclophosphamide group.The low-dose，medium-dose and high-dose groups were given hedgehog polysaccharide 25，50 and 100 mg/kg，orally，once a day，and for 10 days.The model group was given normal saline 0.2 mL/day orally and for 10 days.Cyclophosphamide was administered with 40mg/kg by intraperitoneal injection once a day for 5 days.All the mice were killed after 10 days of treatment.We calculated the inhibition rate of each group.The apoptosis in each group was detected by TUNEL assay.Caspase-3 protein was detected by immunohistochemical method.Results The tumor inhibition rates in the low-dose group，medium-dose group，high-dose group and cyclophosphamide group were 36.36%，57.57%，43.93% and 74.24%.The tumor inhibition rate in the cyclophosphamide group was higher than those in the other groups，and in the medium-dose group，the tumor inhibition rate was higher than those of the low-dose group and high-dose group ( all P＜0.05).The number of apoptotic cells and Caspase-3 protein expression were as follows: cyclophosphamide group＞medium-dose group＞high-dose group＞low-dose group＞model group ( all P＜0.05).Conclusion Hericium erinaceus polysaccharide can inhibit the growth of xenograft sarcoma，and the dose of 50 mg/kg dose is the best.This mechanism may be related to its up-regulation of Caspase-3 protein expression and thereby promoting tumor cell apoptosis.

Key words:Hericium erinaceus polysaccharide; sarcoma; apoptosis; apoptosis-related protein

肉瘤是指來源于間葉組織的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚、皮下、骨膜及長骨兩端。目前臨床常采用手術(shù)切除肉瘤再行放、化療的聯(lián)合治療方法，但療效較差，不良反應(yīng)多，且易產(chǎn)生抗藥性［1］。因此，尋找高效、低毒的治療藥物是目前的研究熱點(diǎn)。猴頭多糖是猴頭菌的主要生物活性成分，能提高人體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［2，3］。目前，猴頭多糖治療肉瘤效果及其作用機(jī)制尚不明確。2014年1～10月，我們觀察了猴頭多糖對(duì)小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，從細(xì)胞凋亡角度探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料健康6～8周齡昆明小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量( 20±2) g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)、手術(shù)、給藥及取材等環(huán)節(jié)均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定;小鼠S180肉瘤細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;猴頭多糖由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備;免疫組化檢測(cè)試劑盒、兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)13110925)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1皮下移植瘤模型制備與分組將S180肉瘤細(xì)胞( 5×105/mL，每只0.2 mL，腹腔注射)接種于昆明小鼠腹腔培養(yǎng)，在SPF環(huán)境飼養(yǎng)下小鼠狀態(tài)良好; 7～10 d后抽取腹水，計(jì)數(shù)細(xì)胞后用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至2×107/mL，在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤細(xì)胞0.2 mL/只。50只接種小鼠在接種后當(dāng)天隨機(jī)分成模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、環(huán)磷酰胺組，每組10只。

1.2.2藥物干預(yù)接種6 h后，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別予猴頭多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干預(yù)10 d;環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，1次/d，共干預(yù)5 d;模型組予生理鹽水0.2 mL/d灌胃，共干預(yù)10 d。

1.2.3抑瘤作用觀察干預(yù)后稱量各組小鼠體質(zhì)量，頸部脫臼法處死;完整剝離右前腋下腫瘤組織，冰冷生理鹽水清洗后、濾紙吸干。取模型組之外的各組腫瘤組織，稱重，計(jì)算各組抑瘤率。抑瘤率=(模型組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡觀察采用TUNEL法。將腫瘤組織石蠟切片后，PBS漂洗，蛋白酶K室溫孵育;加入轉(zhuǎn)化劑PDB，在濕盒中孵育; DAB底物溶液顯色，蘇木精復(fù)染，封固，40倍鏡下觀察。凋亡細(xì)胞呈棕黃色，胞體縮小，核固縮。每張切片選取10個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.2.5肉瘤組織Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)將腫瘤組織固定，包埋、切片。采用免疫組化法檢測(cè)，按試劑盒說明操作。陽性細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色。按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分:無陽性細(xì)胞為0分; 1%～25%為1分; 25%～50%為2分; 50%～75%為3分; 75%～100%為4分。按染色強(qiáng)度評(píng)分:無色為0分;弱陽性為1分;中等強(qiáng)度為2分;強(qiáng)陽性為3分。兩者得分相加為最后評(píng)分，以得分平均值表示Caspase-3蛋白表達(dá)量［4］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組抑瘤率比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、環(huán)磷酰胺組抑瘤率分別為36.36%、57.57%、43.93%、74.24%。環(huán)磷酰胺組抑瘤率明顯高于其余各組，中劑量組抑瘤率明顯高于低劑量組、高劑量組( P均＜0.05)。

2.2各組凋亡細(xì)胞比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環(huán)磷酰胺組凋亡細(xì)胞分別為( 4.600±0.516)、( 10.100±0.875)、( 8.900± 1.398)、( 2.300±0.949)、( 13.600±0.516)個(gè)，細(xì)胞凋亡數(shù)為環(huán)磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組( P均＜0.05)。

2.3各組肉瘤組織Caspase-3蛋白表達(dá)比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環(huán)磷酰胺組的Caspase-3蛋白表達(dá)水平分別為( 3.100±0.737)、( 6.600±0.516)、( 4.700±0.948)、( 2.400± 0.699)、( 6.700±0.483)分，Caspase-3蛋白表達(dá)水平為環(huán)磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組( P均＜0.05)。

3　討論

肉瘤是一種少見且惡性程度高的腫瘤，根據(jù)發(fā)生部位可分為骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等，預(yù)后多不理想。其預(yù)后主要取決于治療時(shí)機(jī)，以及手術(shù)是否徹底、有無轉(zhuǎn)移、患者對(duì)放化療的敏感程度等［5～7］。環(huán)磷酰胺是臨床應(yīng)用多年的抗腫瘤藥物，因其抑瘤作用穩(wěn)定，常被作為陽性對(duì)照藥物。

細(xì)胞凋亡是一種生理性細(xì)胞程序性死亡，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，受多種因素的影響。近年來，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來治療腫瘤的研究成為熱點(diǎn)。Caspase-3蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的

主要蛋白之一，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的功能。有研究表明，Caspase-3能夠破壞細(xì)胞的修復(fù)作用，引起細(xì)胞周期的阻滯［8］;并且，Caspase-3能夠通過降解凋亡抑制蛋白( Bcl-2)而被Caspase家族上游起始蛋白激活，從而形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9～12］。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)生物應(yīng)答、誘導(dǎo)分化、抑制腫瘤血管系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)耐藥性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、影響蛋白表達(dá)等作用［13］。猴頭多糖是從優(yōu)質(zhì)猴頭菇子實(shí)體中提取的有效活性成分?！吨袊幱谜婢酚涊d，猴頭菌性平，味甘，能利五臟，助消化，滋補(bǔ)，抗癌，治療神經(jīng)衰弱等。近年研究發(fā)現(xiàn)，猴頭多糖是其最重要的活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎、抗突變、抗輻射等功能?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)是抗腫瘤的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，猴頭多糖能提高荷瘤小鼠的免疫指數(shù)，下調(diào)荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)水平，上調(diào)Bax的表達(dá)。表明其可通過提高小鼠的免疫功能來達(dá)到抗腫瘤的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量組抑瘤率最高，提示猴頭多糖中劑量能夠有效抑制小鼠S180肉瘤生長，抑瘤作用較好，但低于環(huán)磷酰胺組。中劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)最多，低劑量組凋亡細(xì)胞最少。低、中、高劑量組Caspase-3均高表達(dá)，以中劑量組最高。提示猴頭多糖可抑制腫瘤增長，可能與調(diào)節(jié)Caspase-3活性介導(dǎo)小鼠S180細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，猴頭多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生長，以50 mg/kg劑量作用最佳;該作用與其增加Caspase-3蛋白表達(dá)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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收稿日期:( 2015-05-25)

通信作者簡介:孫力( 1962-)，女，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴幙鼓[瘤的分子生物學(xué)機(jī)制。E-mail: sunli0129@ hotmail.com

作者簡介:第一姜穎( 1981-)，女，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴幙鼓[瘤的分子生物學(xué)機(jī)制。E-mail: jiangying1222@163.com

基金項(xiàng)目:黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 201329) ;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金資助項(xiàng)目( 201409)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)30-0008-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R73-354

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.003