■同仲彬 楊 蕊 嚴(yán)昌國(guó) 辛宗瑞 文炳憲 李香子

（延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，吉林延邊 133002）

1950年，Roberts在哺乳動(dòng)物腦灰質(zhì)中首次發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸（GABA），同年Awapara和Udenfriend也發(fā)現(xiàn)了這一物質(zhì)。1966年，經(jīng)Kmjevic等人研究且明確表明，GABA在哺乳動(dòng)物大腦中模仿內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)工作。1975年，在第二屆國(guó)際GABA專(zhuān)題討論會(huì)，GABA被確認(rèn)為哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)。

γ-氨基丁酸，又名4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，分子式為C4H9NO2，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的一種四碳非蛋白質(zhì)天然氨基酸。γ-氨基丁酸是一種白色或類(lèi)白色結(jié)晶性粉末，微臭，微苦，無(wú)旋光性，極易溶于水，25℃時(shí)溶解度為130 g/100 ml，微溶于熱乙醇，不溶于冷乙醇、苯、乙醚等常見(jiàn)有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)202～204℃，熔化時(shí)分解生成吡咯烷酮和水。GABA是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，GABA具有增進(jìn)食欲，促進(jìn)消化，抗心率失常，降血壓，鎮(zhèn)靜、抗驚厥，調(diào)節(jié)激素分泌等功能。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GABA只存在于神經(jīng)組織中，由谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）轉(zhuǎn)化谷氨酸而成。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、大腸桿菌以及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌種，但是大腸桿菌在安全性方面存在隱患，乳酸菌被公認(rèn)為是安全的益生菌，所以用乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有廣闊的前景。

1 GABA的合成方法

目前，制備GABA的方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法。

1.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法常用的有兩種：一種是以鄰苯二甲酰亞氨鉀和γ-氯丁氰在180℃反應(yīng)，產(chǎn)物與濃硫酸回流水解，再經(jīng)結(jié)晶提純而得；另外一種是以吡咯烷酮作為原料，經(jīng)碳酸氫銨、氫氧化鈣水解制得。最近，楊東元等采用一種新的方法，是以γ-丁內(nèi)酯為起始原料，經(jīng)氯化酯化反應(yīng)，生成4-氯丁酸甲酯，再經(jīng)氨解和皂化反應(yīng)制得GABA，總收率達(dá)57.9%。運(yùn)用化學(xué)合成法生產(chǎn)GABA雖然反應(yīng)迅速，產(chǎn)品純度高，但是在生產(chǎn)過(guò)程使用了危險(xiǎn)溶劑，脫除產(chǎn)品中的有毒成分比較復(fù)雜且反應(yīng)條件苛刻、能耗大、成本大，其主要被應(yīng)用于化工領(lǐng)域，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用仍存在一定的安全隱患。但是，隨著人們對(duì)合成原料的不斷研究更新，對(duì)合成工藝的不斷完善，相信化學(xué)合成能夠在安全性方面取得更大的突破。

1.2 植物富集法

植物富集主要包括兩條途徑：一條是轉(zhuǎn)化途徑(主要途徑)，谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化合成GABA，是植物組織對(duì)外界條件應(yīng)激代謝所生成(外界應(yīng)激條件包括溫度、壓力、破碎、研磨、Ca2+濃度、H+濃度和氧濃度等)；另外一條是多胺降解，植物體內(nèi)的多胺在二胺氧化酶的作用下，氧化脫氨形成H2O2、氨和4-氨基丁醛，然后4-氨基丁醛脫水形成1-吡咯啉，在吡咯啉脫氫酶催化作用下1-吡咯啉生成GABA。Komatsuzaki等研究稻米在浸泡3 h后，在35℃通氣培養(yǎng)，稻米中GABA含量可達(dá)24.9 mg/100 g。Ta?kashi Iimurea等在150 mg/ml大麥麩中加入谷氨酸鈉10 mmol，不加任何輔酶和緩沖液，在20℃下反應(yīng)6 h，GABA濃度可達(dá)11.0 mmol，同樣條件下運(yùn)用小麥和米糠，GABA濃度分別為3.9 mmol和 0.8 mmol。近年來(lái)，我國(guó)許多研究人員也進(jìn)行了植物（大豆、糙米、茶葉）富集GABA的研究。雖然天然產(chǎn)物提取法在操作上簡(jiǎn)單易行，但由于植物富集的GABA含量較低且分離提取比較困難，所以不適合規(guī)模化生產(chǎn)。

1.3 微生物發(fā)酵法

谷氨酸脫羧酶（glutamate decar?boxylase，GAD)是特異性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于多種細(xì)菌和真核微生物。大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用于GABA生產(chǎn)。早期研究大多以大腸桿菌生物合成GABA為主，利用大腸桿菌產(chǎn)生的高活性GAD作用，將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA。Plokhov等、趙景聯(lián)都利用大腸桿菌得到GA?BA。含有谷氨酸脫羧酶的曲霉也可用于GABA的生產(chǎn)，胡珊等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選獲得一株γ-氨基丁酸高產(chǎn)紅曲酶菌MXL-8，通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)基、發(fā)酵條件，最終使GABA產(chǎn)量達(dá)到了22.373 mg/ml；同樣含有谷氨酸脫羧酶的酵母菌也可用于生產(chǎn)GABA，胡超等采用單因素及正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母產(chǎn)γ-氨基丁酸（GA?BA）的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在此培養(yǎng)條件下，搖瓶發(fā)酵可以獲得GABA的產(chǎn)量為1.690 g/l。雖然大腸桿菌谷氨酸脫羧酶活性較高，生產(chǎn)GABA在得率上具有較大的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)于食品工業(yè)來(lái)說(shuō)，以大腸桿菌生產(chǎn)GABA在安全衛(wèi)生方面會(huì)存在較大的隱患。乳酸菌是具有極強(qiáng)GABA發(fā)酵能力且被國(guó)際公認(rèn)的食品安全級(jí)微生物，可直接用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，有望成為生物發(fā)酵GABA的最理想菌種。

2 分離的乳酸菌合成GABA研究概況

目前，各國(guó)學(xué)者已經(jīng)篩選出了多株產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株。Kom?atsuzaki等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到一株乳酸菌Lactobacillus para?caseiNFRI 7415，其產(chǎn)GABA的能力達(dá)到了302 mmol/l；Kim S H等從韓國(guó)泡菜中分離到了產(chǎn)GABA的短乳桿菌，此菌培養(yǎng)48 h在MRS培養(yǎng)基中由50 g/l谷氨酸鈉生成194 mM(約 20 000 mg/l)GABA，轉(zhuǎn)化率達(dá)73%。Marina Diana等從西班牙干酪中篩選出四株產(chǎn)GABA較高的乳酸菌菌株，L.brevisCECT 8183、L.brevisCECT 8181、L.brevisCECT 8182、Lactic ssp lacticCECT 8184，對(duì)溶有20%的小麥粉進(jìn)行發(fā)酵24 h，其中L.brevisCE?CT 8182產(chǎn)GABA濃度最大為(0.99±0.01)mmol/l。

國(guó)內(nèi)利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA也有眾多的研究，范杰等從酸菜、泡菜、奶酪等中篩選出一株短乳桿菌，其在含有10 g/l MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)GABA能力達(dá)到5.72 g/l。周青等從不同泡菜中篩選出產(chǎn)GABA相對(duì)較高的植物乳桿菌，其在發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)GABA量為1.261 g/l。龔福明等從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選得到高產(chǎn)GABA的菌株L.plantarumYM-4-3，其在最適轉(zhuǎn)化條件下（35℃，MSG含量3%，初始pH值6.0，靜置厭氧發(fā)酵96 h)產(chǎn)GABA高達(dá)0.913 g/l。

從國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究中，可以看到分離的不同乳酸菌產(chǎn)GABA的能力是不同的且差異比較顯著，所以我們?cè)谶x擇的時(shí)候盡量選擇產(chǎn)GABA能力強(qiáng)的菌株，并繼續(xù)對(duì)其發(fā)酵環(huán)境（溫度、pH值、氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽、培養(yǎng)時(shí)間等）進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化及誘變育種

3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，不僅可以確定不同菌種的最適發(fā)酵條件，也可以節(jié)約成本，得出最優(yōu)的產(chǎn)GABA方案，進(jìn)一步運(yùn)用于生產(chǎn)中。發(fā)酵條件優(yōu)化包括培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵溫度、pH值的控制，谷氨酸加入量及加入時(shí)間的控制等。

馮宇等研究分離自酸菜的菌株Lactobacillus bre?visTCCC13007，對(duì)其以MRS為基礎(chǔ)的GABA發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了葡萄糖、黃豆粉和玉米漿的最佳取值，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為(g/l)：葡萄糖21.80、黃豆粉36.30、玉米漿25.90、硫酸錳0.25、MSG 50，GABA產(chǎn)量為27.12 g/l，比液體MRS培養(yǎng)基的產(chǎn)量14.03 g/l提高了93.30%。范杰等以分離自泡菜的短乳桿菌(菌株Lacto?bacillus brevisSPFJ11412.1)為研究對(duì)象，得到的最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10.92 g/l、蛋白胨29.67 g/l、牛肉膏39.66 g/l、硫酸錳0.06 g/l、維生素B60.02 g/l。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中添加3%的谷氨酸鈉，33℃發(fā)酵72 h，發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量達(dá)到14.15 g/l，比原始的4.17 g/l提高了約240%。謝曉陽(yáng)等選取前期研究分離鑒定的高產(chǎn)GABA的富鋅短乳桿菌L.brevisBS2作為研究對(duì)象，通過(guò)15 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批及補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出通過(guò)發(fā)酵44 h后向培養(yǎng)基中補(bǔ)加葡萄糖，培養(yǎng)過(guò)程中控制pH值在5.0左右，并且分別在32、56 h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加添加谷氨酸鈉，使發(fā)酵液中谷氨酸的含量達(dá)到20 g/l左右，發(fā)酵104 h GABA含量達(dá)33 g/l，產(chǎn)量提高2.5倍左右。Chunlong Peng等研究短乳桿菌CGMCC1306在發(fā)酵培養(yǎng)基(GYP)中控制pH值、溫度和不同時(shí)段添加LMSG的產(chǎn)GABA量，得出先控制pH值5.0和溫度35℃發(fā)酵32 h，后調(diào)整控制pH值4.5和溫度40℃進(jìn)行發(fā)酵，并且在32 h及56 h的時(shí)候添加L-MSG 20 g，發(fā)酵至72 h，GABA的濃度可以達(dá)到最大(526.33 mmol/l)，比單一控制pH值發(fā)酵產(chǎn)GABA濃度提高了32%。

3.2 誘變育種

為獲得高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株，研究表明，也可以通過(guò)物理誘變和化學(xué)誘變對(duì)菌株進(jìn)行特定處理，把出發(fā)菌株改造成能在特定的條件下進(jìn)行異常代謝，引導(dǎo)菌株生物合成的代謝途徑朝人們所期望的方向發(fā)展，獲得所需要的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌種。

紫外線照射可使DNA分子形成嘧啶二聚體，二聚體的形成會(huì)阻礙堿基間正常配對(duì)，引起突變甚至死亡。亞硝基胍不僅可以增加DNA分子烷基側(cè)鏈，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，而且可以在DNA雙鏈間形成共價(jià)鍵，該共價(jià)鍵阻礙了DNA復(fù)制過(guò)程中雙鏈的解開(kāi)，從而引起突變。

李秀涼等對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的乳酸片球菌先后進(jìn)行紫外線誘變、亞硝基胍誘變以及二者的復(fù)合誘變，發(fā)現(xiàn)紫外線誘變的最佳條件為18 W的紫外燈下，距離25 cm處，照射20 s；NTG誘變的較佳條件是終濃度為0.3 mg/ml，處理時(shí)間60 min；誘變后獲得了1株突變株UN-27，連續(xù)傳代10次，平均GABA的產(chǎn)量為5.017 g/l，是初始菌株（1.062 g/l）的4.72倍。葛菁萍等對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6株乳酸菌進(jìn)行篩選得到一株產(chǎn)GABA較高的菌株短乳桿菌HDBR-02經(jīng)過(guò)UV誘變、NTG誘變和UV、NTG復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)GABA的突變株F11，誘變后菌株GABA產(chǎn)量達(dá)到0.87 mmol/l，是出發(fā)菌株產(chǎn)量（0.21 mmol/l）的4倍多，最佳誘變劑量為紫外照射時(shí)間為13 s、距離24 cm，NTG濃度為0.6 mg/ml、誘變處理時(shí)間為30 min。并且對(duì)UV及NTG誘變效果進(jìn)行比較，UV誘變所得菌株UV-1的GABA產(chǎn)量從初始菌株的0.21 mmol/l提高到0.42 mmol/l，產(chǎn)量提高了1倍，GABA增加量為0.21 mmol/l。 而再經(jīng)NTG誘變之后，GABA產(chǎn)量達(dá)到 0.72 mmol/l，提高了大約3倍，由此可以直接看出NTG誘變的效果比UV誘變明顯。吳非等從接入豆?jié){（大豆∶水=1∶8）的乳酸菌中篩選出一株產(chǎn)GABA較高的菌株保加利亞乳桿菌L2，在最佳紫外線照射條件下（照射時(shí)間為50 s），得到高產(chǎn)GABA突變菌株L2-4，其在豆?jié){中的GABA產(chǎn)量為1.394 g/l，在含有1%L-谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量為4.235 g/l。

誘變育種雖然也可以提高菌株GABA產(chǎn)量，但此方法有利變異少，誘變的方向和性質(zhì)不能控制，且易產(chǎn)生回復(fù)突變，工作量大，要想大幅度提高GABA產(chǎn)量，誘變育種還是有很大局限性的。

4 谷氨酸脫羧酶基因

通過(guò)研究培養(yǎng)基優(yōu)化跟誘變育種可知，這兩種方法雖然能夠提高乳酸菌菌株產(chǎn)GABA的能力，但是操作過(guò)程麻煩，耗時(shí)，針對(duì)性不強(qiáng)，且GAD的表達(dá)受菌體代謝狀態(tài)的控制，蛋白表達(dá)量及活力有限，對(duì)大幅度提高乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力不顯著，所以研究者漸漸開(kāi)始將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向GABA限速酶——谷氨酸脫羧酶(GAD)。GAD是由酶蛋白與磷酸吡哆醛（PLP）組成的，PLP是GAD的輔基，它對(duì)GAD的活性發(fā)揮起著至關(guān)緊要的作用。研究谷氨酸脫羧酶基因，使生產(chǎn)GABA向著目的明確的方向發(fā)展。

乳酸菌活體細(xì)胞中存在谷氨酸脫羧酶(GAD)，隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員開(kāi)始研究通過(guò)克隆谷氨酸脫羧酶基因并導(dǎo)入其它菌株來(lái)表達(dá)，以這種方式來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力。

在GABA的基因工程生產(chǎn)方面，Park K B等將來(lái)源于L.brevis OPK-3的谷氨酸脫羧酶編碼基因利用基因工程的手段轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，并使其得到表達(dá)，而且使 GA?BA的產(chǎn)量高于野生型；Kook M C等將L.plantarumATCC 14917的GAD在L.sakei中表達(dá)，GABA產(chǎn)量提高了1.3倍左右；Chihiro T等將來(lái)源于大腸桿菌W3110的GAD在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)，使最終GABA產(chǎn)量達(dá)12.37 g/l。

田靈芝等克隆了一株經(jīng)過(guò)誘變篩選的具有較高谷氨酸脫羧酶活力植物乳桿菌GB 01-21的全基因組DNA的谷氨酸脫羧酶(GAD)編碼基因lpgad，構(gòu)建了一株重組大腸桿菌E.coliBL21/pET-28a-lpgad，并經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)了有活性的重組蛋白GAD，在經(jīng)1.5 g/l乳糖誘導(dǎo)8 h，重組菌粗酶液測(cè)得酶活力為331.56 U/ml，比酶活為8.53 U/mg，是出發(fā)菌株植物乳桿菌粗酶液酶活的4.24倍。李佑新等成功將其篩選的L.brevisLB85編碼谷氨酸脫羧酶基因的四個(gè)PCR擴(kuò)增片段 gadB1、gadB2、gadCB2 與gadRCB2連入大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體 pDXW-8、pDXW-9、pDXW-10中，并將于大腸桿菌中構(gòu)建好的重組質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌中，得到最優(yōu)重組菌株ATCC 13032/pDXW-10/gadRCB2，其在葡萄糖濃度為5%、添加 2或 3次尿素、250 ml的三角瓶中裝有10 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基積累的GABA較多，GABA的產(chǎn)量最終可達(dá)到2.41 g/l。

由于基因工程針對(duì)性和可控制性強(qiáng)，所以國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于不管是乳酸菌還是其他有益的微生物生產(chǎn)GABA的研究重點(diǎn)都已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了研究谷氨酸脫羧酶基因上，這對(duì)以后大量生產(chǎn)GABA是非常有益的。但由于不同微生物來(lái)源的GAD不僅在分子量大小上存在差異,在酶學(xué)性質(zhì)方面也存在一定的差異，主要表現(xiàn)在pH值和溫度上，所以在研究谷氨酸脫羧酶基因時(shí)，應(yīng)先了解各個(gè)微生物酶的酶學(xué)性質(zhì)，以便更好地利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)GABA。

5 展望

本文簡(jiǎn)單地闡述了幾種合成GABA的方法，重點(diǎn)論述了利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)作了簡(jiǎn)要分析。通過(guò)比較，利用基因工程生產(chǎn)GABA的量雖然不高，但與初始菌株相比，提高倍數(shù)也是喜人的，而且此方法也可以大大降低生產(chǎn)成本。在以后的研究中，這幾種方法也許可以綜合起來(lái)以最經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)最多的GABA。

（參考文獻(xiàn)56篇，刊略，需者可函索）