趙永見，薛純純，王利波，李曉鋒，施 杞，王擁軍，舒 冰△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032)

黃芪甲苷對(duì)關(guān)節(jié)不穩(wěn)誘導(dǎo)型小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用*

趙永見1，2，薛純純1，2，王利波1，2，李曉鋒1，2，施 杞1，2，王擁軍1，2，舒 冰1，2△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032)

目的:觀察黃芪甲苷能否緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。方法:將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和黃芪甲苷組，實(shí)驗(yàn)組通過關(guān)節(jié)不穩(wěn)術(shù)造成小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，并分別給予生理鹽水和黃芪甲苷腹腔注射8周。取左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行三維重建和組織學(xué)染色。結(jié)果:模型組小鼠膝關(guān)節(jié)半月板鈣化明顯增加，關(guān)節(jié)軟骨變薄，II型膠原明顯減少，破壞明顯，邊緣骨贅形成;黃芪甲苷組均有明顯改善。結(jié)論:黃芪甲苷可以減輕關(guān)節(jié)不穩(wěn)誘導(dǎo)的小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎病理改變。

膝骨關(guān)節(jié)炎;黃芪甲苷;軟骨退變

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限甚至關(guān)節(jié)功能喪失、病理改變以進(jìn)行性膝關(guān)節(jié)軟骨丟失、關(guān)節(jié)緣骨贅生成、滑膜炎癥和增生、半月板鈣化為特點(diǎn)［1］。由于該病發(fā)病率高、遷延難愈，嚴(yán)重影響到患者的生活質(zhì)量［2］。

半月板是位于膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨關(guān)節(jié)表面之間的半環(huán)形纖維軟骨結(jié)構(gòu)，其主要生理功能是在膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)或者靜態(tài)受壓時(shí)緩沖并分散壓力，具有維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性和潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用。前交叉韌帶起于股骨外髁的內(nèi)側(cè)面，止于脛骨髁間嵴之間，是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的重要結(jié)構(gòu)。臨床上半月板和前交叉韌帶損傷可導(dǎo)致關(guān)節(jié)失穩(wěn)、壓力緩沖失常、關(guān)節(jié)表面受壓增大且分布不均，關(guān)節(jié)軟骨功能異常發(fā)生退變。因此，通過給小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板聯(lián)合前交叉韌帶離斷術(shù)，可以模擬膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［3］。

施杞教授總結(jié)出氣血不足為本病發(fā)病之本，氣滯血瘀為病機(jī)之關(guān)鍵，提出“益氣化瘀、標(biāo)本兼顧”的治療法則。黃芪為補(bǔ)氣圣藥，臨床常重用黃芪治療此類疾病，療效顯著。黃芪甲苷是黃芪的主要有效組分之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的藥理學(xué)作用［4］。我們通過給予小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板聯(lián)合前交叉韌帶離斷術(shù)，模擬膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，體內(nèi)驗(yàn)證黃芪甲苷是否對(duì)關(guān)節(jié)不穩(wěn)誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型制備

12周齡雄性野生型C57/B6小鼠20只分為模型組與黃芪甲苷組，每組10只。將小鼠以氯胺胴(0.5 mg/10 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)備皮，碘伏消毒，以膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)水平為中心，沿脛骨內(nèi)側(cè)做2 cm縱形切口，離斷內(nèi)側(cè)副韌帶，沿脛骨平臺(tái)打開膝關(guān)節(jié)腔。仔細(xì)游離出內(nèi)側(cè)半月板，從中間離斷，并進(jìn)一步離斷前交叉韌帶，關(guān)閉關(guān)節(jié)腔，縫合筋膜和皮膚［5］。取10只雄性野生型C57/B6小鼠作為假手術(shù)對(duì)照組，左側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做皮膚切開并縫合。術(shù)后小鼠自由活動(dòng)，常規(guī)飲食飼養(yǎng)。

1.2 藥物干預(yù)

術(shù)后第2天起，將黃芪甲苷與玉米油溶解后配成10 m g/ml，實(shí)驗(yàn)組小鼠按每只每次0.1ml/10 g/d腹腔注射8周。黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS:83207-58-3)購(gòu)自上海藥檢所上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司。模型組和假手術(shù)組分別給予等體積玉米油腹腔注射。

1.3 取材與標(biāo)本處理

藥物干預(yù)8周后，將小鼠以氯胺酮麻醉處死，取出左側(cè)膝關(guān)節(jié)，剔除周圍肌肉結(jié)締組織，在10% NBF(VWR)中固定2 d，去離子水沖洗。

1.4 Micro-CT掃描及三維重建分析

用SCANCO Micro-CT80對(duì)固定好的小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描，電壓55 kV，電流72 uA，以10 um的斷層厚度掃描500個(gè)層面。以300 ms積分時(shí)間進(jìn)行2D重建，以230～1000閾值范圍進(jìn)行3D重建。

1.5 組織形態(tài)學(xué)觀察

將固定后的膝關(guān)節(jié)以蟻酸脫鈣液脫鈣9 d，梯度酒精常規(guī)脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。于脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)處切取4 μm厚失狀位連續(xù)切片。切片烤片后分別經(jīng)二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水后進(jìn)行阿爾辛蘭/橙黃G染色。切片分別經(jīng)過1%鹽酸/乙醇30 s，1%阿爾辛蘭/蘇木素30 min，1%鹽酸/乙醇2 s，0.5%氨水15 s，95%乙醇1 min，橙黃G/伊紅染液(0.5%橙黃+2%伊紅)1.5 min。再經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察分析膝關(guān)節(jié)病理改變。

1.6 免疫組織化學(xué)染色方法

切片經(jīng)過二甲苯和梯度酒精常規(guī)脫蠟至水，4%中性多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后，3%過氧化氫(H2O2)浸泡10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，以10 mg/ml蛋白酶K常溫消化10 min以進(jìn)行抗原修復(fù)。5%山羊血清封閉30 min，以兔抗II型膠原抗體(Abcam，ab34712)4℃孵育過夜，陰性對(duì)照用PBS代替I抗。PBS反復(fù)沖洗后，1∶200山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗后滴加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色劑顯色3 min，清水沖凈，蘇木素復(fù)染后鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。棕色染色為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)著色為陰性。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)三維重建

假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)光滑平整，內(nèi)側(cè)半月板處可見形狀規(guī)則的楔形鈣化組織。術(shù)后8周，模型組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)邊緣骨贅生成，內(nèi)側(cè)半月板處骨組織明顯增大，且形狀不規(guī)則。黃芪甲苷組脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)邊緣稍有骨贅生成和，內(nèi)側(cè)半月板骨組織增大較模型組減輕(圖1)。

2.2 膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變

阿爾辛蘭/橙黃G染色淡藍(lán)色示軟骨組織，橙黃色示骨組織。假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨深層染色較深，淺層染色稍淺，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，細(xì)胞排列整齊。半月板形態(tài)規(guī)則外周為軟骨組織，內(nèi)部可見少量鈣化骨組織。術(shù)后8周，模型組膝關(guān)節(jié)軟骨表面破損，軟骨層明顯變薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂，關(guān)節(jié)軟骨邊緣骨贅形成，半月板及內(nèi)部鈣化組織均明顯增大，且形態(tài)不規(guī)則。黃芪甲苷組膝關(guān)節(jié)軟骨表面稍有不平，軟骨層輕微變薄，表層染色減少，軟骨邊緣骨贅形成有限，內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)部鈣化組織稍有增大(圖2)。

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原表達(dá)

免疫組化顯示，假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨深層II型膠原染色豐富，表層染色稍淺，分布均勻。模型組膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原染色明顯變薄，以表層丟失為主。黃芪甲苷組膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原染色稍有減少，但仍具有表層淺染、深層深染、染色連續(xù)性的特點(diǎn)，表層染色稍有不均勻(圖3)。表明模型組膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的II型膠原顯著降低，黃芪甲苷組膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的II型膠原在表達(dá)水平和分布方式上均有改善。

圖1 膝關(guān)節(jié)三維重建圖

3 討論

圖2 膝關(guān)節(jié)阿爾辛蘭/橙黃G染色

圖3 膝關(guān)節(jié)II型膠原免疫組化染色

II型膠原是彈性軟骨的主要細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于緩沖壓力有著重要作用，同時(shí)它也是軟骨細(xì)胞特有的分子標(biāo)志［5］。在生理?xiàng)l件下，關(guān)節(jié)軟骨維持著軟骨特征，不向肥大軟骨細(xì)胞分化，但在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中，細(xì)胞外基質(zhì)中的II型膠原和蛋白多糖降解，軟骨細(xì)胞的特性發(fā)生變化，不能維持軟骨組織的特征。

本研究通過離斷小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板和前交叉韌帶，模擬膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)狀態(tài)，誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎。膝關(guān)節(jié)的三維重建和組織學(xué)染色顯示出典型的骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，包括關(guān)節(jié)表面破壞，軟骨層變薄，軟骨邊緣骨贅生成，半月板鈣化，II型膠原表達(dá)降低。

黃芪甲苷是黃芪的重要生理活性成分，常作為黃芪藥材的定性定量指標(biāo)。黃芪甲苷的主要藥理作用包括抗炎抗病毒、免疫調(diào)節(jié)作用［6］，抗氧化、缺氧及缺氧/復(fù)氧損傷［7-8］引起的細(xì)胞損傷。針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對(duì)佐劑型大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎有一定的保護(hù)作用［9］，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNFα)的表達(dá)［10-11］，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)［12-13］。據(jù)此我們推測(cè)，黃芪甲苷可能通過抑制軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及合成細(xì)胞外基質(zhì)，部分緩解關(guān)節(jié)不穩(wěn)誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

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Protective Effect of the Astragalus IV on the Knee Osteoarthritis Induced by Joint Instability in Mice

ZHAO Yong-jian1，2，XUE Chun-chun1，2，WANG Li-bo1，2，LI Xiao-feng1，2，SHI Qi1，2，WANG Yong-jun1，2，SHU Bing1，2
(1.Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2.Spine Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China)

Objective:to observe the effect of Astragaloside on the pathological changes of knee osteoarthritis.Methods:mice were randomly divided into sham group，model group and Astragaloside IV group.Mice in model group and Astragaloside IV group were performed surgery in left knee joints to induce knee osteoarthritis，and were treated with saline and Astragaloside IV respectively.After 8 week-treatment，the left knee joints were harvested for Micro-CT scanning and reconstruction and pathological observation.Results:obvious meniscus ossification，thinner articular cartilage with cracks and decreased Type II collagen staining，and osteophyte at the edge of articular cartilage were developed in the left knee joints of model group.Changes of articular cartilage and meniscus in Astragaloside IV were clearly better than model group.Conclusion:Astragaloside IV could alleviate articular cartilage degeneration in knee osteoarthritis mice model.

knee osteoarthritis;Astragaloside IV;cartilage degeneration

R684.3

B

1006-3250(2015)06-0668-03

2015-01-06

上海市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(12ZR1450400)-BMP2在軟骨細(xì)胞退變中的作用及益氣化瘀中藥調(diào)節(jié)BMP/Smad信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞退變的研究;上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃(ZZSZY12064)-黃芪甲苷調(diào)節(jié)BMP/Smad信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞退變的研究;國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81403239)-腎性骨病方調(diào)節(jié)BMP/Smad信號(hào)通路防治腎性骨病的研究;國(guó)家教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”發(fā)展計(jì)劃(IRT1270)-中醫(yī)“腎主骨”理論的應(yīng)用基礎(chǔ)研究;上海中醫(yī)藥大學(xué)“085工程”中醫(yī)藥學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(085ZY1204)-中醫(yī)“腎藏精”及“腎主骨”理論的臨床與基礎(chǔ)研究;上海高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)隊(duì)伍建設(shè)計(jì)劃(LH01.24.001)

趙永見(1983-)，男，山東臨沂人，檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事中醫(yī)藥防治骨與軟骨退行性病變的臨床與研究。

△通訊作者:舒 冰，女，助理研究員，E-mail:shubing523@ hotmail.com。