楊雨果，楊金鎖

(河南省南陽市南陽醫(yī)學高等專科學校，河南南陽 473061)

化痰除濕法對早期實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

楊雨果，楊金鎖

(河南省南陽市南陽醫(yī)學高等?？茖W校，河南南陽 473061)

目的:探討化痰除濕法在早期實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的應(yīng)用研究。方法:選用健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為(250±10)g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法將80只大鼠分為A組化痰除濕法組、B組西藥陽性對照組、C組模型組、D組空白對照組每組各20只。所有的大鼠均采用改良Hulth造模法進行造模實驗，形成骨性關(guān)節(jié)炎模型，第4周開始給藥，干預(yù)4周后取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨光鏡觀察形態(tài)學變化，用原位末端標記法(TUNEL法)、免疫組化法分別觀察軟骨細胞凋亡情況和增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況，以及用放免法測定關(guān)節(jié)液中IL-1、TNFa的含量。結(jié)果:A組的軟骨細胞凋亡指數(shù)小于模型組，而A組的PCNA表達要高于其他各組，化痰除濕法組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1、TNFa的含量均較其他組顯著升高。結(jié)論:化痰除濕法在減少大鼠早期膝關(guān)節(jié)實驗性O(shè)A軟骨細胞的凋亡有著顯著作用，可促進軟骨細胞的增殖，對早期骨關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。

骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細胞;細胞凋亡;化痰除濕法

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthrisis，OA)是一種嚴重慢性進行性骨關(guān)節(jié)病，主要病變主要集中在關(guān)節(jié)軟骨?；颊咭坏┌l(fā)病，最主要的臨床表現(xiàn)為發(fā)展緩慢的以關(guān)節(jié)疼痛、活動僵硬、關(guān)節(jié)腫脹畸形、局部壓痛明顯、活動受限和外觀畸形。目前的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，勞損、創(chuàng)傷、炎癥、代謝或遺傳是最易導致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的因素。其中中老年人為好發(fā)人群，其發(fā)病機制尚不明確，療效也不理想［1-2］。故骨性關(guān)節(jié)炎的治療及其機制的研究是基礎(chǔ)和臨床研究的重點所在。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)發(fā)展，中醫(yī)藥治療骨性關(guān)節(jié)炎有一定的獨特優(yōu)勢，且對該病的發(fā)病機理和藥物作用機制的研究有著更深的研究［3］。本研究旨在探討化痰除濕法對早期實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響，進一步探討骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(250±10) g，雌雄各半，由本院附屬醫(yī)院動物研究所提供。

1.2 實驗用藥

化痰除濕祛瘀劑組方:制南星12 g，制川烏6 g，薏苡仁、丹參、地龍各10 g，刺五加20 g，水煎濃縮，蒸餾水調(diào)藥物濃度調(diào)至每毫升含生藥2.0 g，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。陽性藥物疏酸氨基葡萄糖?.314 g/片，新興同仁藥業(yè)有限公司提供。第一抗體購自美國Zymed公司，TUNEL試劑盒DAMO公司提供，PCNA單克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及動物給藥 采用氯胺酮按20 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，參照Hulth造模型方法，A、B組于無菌條件下切斷其左膝內(nèi)側(cè)副韌帶及切除內(nèi)側(cè)半月板以及前交叉韌帶;C組僅作左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚切開后縫合，D組不作任何手術(shù)處理。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，且每天肌注青霉素2×104U/ kg，共3 d。4周后根據(jù)Meeh-Rubner公式計算兔的給藥，A、B 2組均給予化痰除濕祛瘀劑(4 g生藥量/ kg體質(zhì)量)，C、D組給予生理鹽水25 mL，每天灌胃1次，連續(xù)4周［4］。

1.3.2 取材 干預(yù)4周后處死大鼠(處死前抽取關(guān)節(jié)液進行放射免疫法檢測相關(guān)因子)，切取患側(cè)脛骨全層關(guān)節(jié)軟骨及滑膜，立即放入戊二醛中固定并進行電鏡檢查，部分軟骨和內(nèi)側(cè)脛骨平臺的軟骨切下后放入10% 的甲醛溶液中固定，以便用于PCNA測試。

1.4 檢測方法

1.4.1 凋亡軟骨細胞檢測 采用TUNEL檢測方法，按照參考文獻［5］的實驗步驟進行凋亡軟骨細胞檢測、細胞凋亡指數(shù)(AI)和細胞增殖指數(shù)(PI)判定。AI=TUNEL標記陽性細胞數(shù)/軟骨細胞數(shù)× 100%;PI=PCNA標記陽性細胞數(shù)/軟骨細胞數(shù)× 100%。

1.4.2 免疫組化 冰箱中取出眼組織冰凍切片室溫放置30 min;純丙酮室溫固定20～30 min，蒸餾水洗5 min×3次;純甲醇加H2O2至0.5%，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗5 min×3次;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗;滴加抗體稀釋液稀釋的1∶100的大鼠抗體，置濕盒20℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20 min。PBS沖洗2 min×3次;滴加試劑SABC，37℃20 min。PBS沖洗2 min×3次;DAB顯色:取配制好的DAB液加之切片，室溫避光顯色(控制反應(yīng)時間在10 min)，蒸餾水洗滌10 min，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明封片，顯微鏡下觀察［6］。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用圖像分析儀(Image-Pro Plus 6.0)進行圖像分析，根據(jù)免疫組化陽性的強弱測定其IOD值。所有測量數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差(±s)表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗，組間進行采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學改變

化痰除濕法組部分軟骨剝脫，軟骨表面有少許淺裂隙，軟骨細胞排列較整齊呈柱狀，表面出現(xiàn)少許空隙窩，部分軟骨細胞增大，鈣化層軟骨細胞輕度成簇(圖A);陽性藥物對照組軟骨表面不甚光滑，結(jié)構(gòu)尚清晰，形成鈣化層，骨小梁數(shù)目增多(圖B);模型組軟骨表面變薄出現(xiàn)多個裂隙，部分軟骨剝脫缺損，表面出現(xiàn)多個空隙窩，可見較多裂隙從表層軟骨延伸向下深達放射層，部分軟骨細胞核固縮、壞死并偏向一側(cè)，化層軟骨細胞出現(xiàn)簇積現(xiàn)象，排列紊亂(圖B);空白對照組軟骨表面光滑，呈柱狀排列(圖D)。

注:A.化痰除濕法組(×400);B.陽性藥物對照組(×400);C.模型組(×400);D.空白對照組(×400)

2.2 各組TUNEL觀察和細胞凋亡指數(shù)AI統(tǒng)計結(jié)果

表1圖1顯示，采用TUNEL方法檢測凋亡細胞核呈棕黃色，主要位于軟骨淺層，各層分布明顯，各組間AI比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.36，P＜0.05)。

表1 各組大鼠細胞凋亡指數(shù)(AI)結(jié)果比較

2.3 各組軟骨細胞PCNA免疫組化的觀察和增殖指數(shù)(PI)結(jié)果

注:A.模型組TUNEL(×40);B.化痰除濕組PCNA表達(×40)

圖1表2顯示，各組經(jīng)免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，化痰除濕組表層和中層PCNA染色體陽性細胞較多，而模型組軟骨淺表層PCNA陽性細胞較多，并可見呈巢樣增生的軟骨細胞，主要位于軟骨中層，染色大多呈陽性。

表2 各組增殖指數(shù)(PI)結(jié)果

2.4 各組關(guān)節(jié)液中IL-1及TNFa含量比較

表3顯示，化痰除濕法組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1、TNFa的含量均較對照組顯著升高(P＜0.05)。

表3 各組關(guān)節(jié)液中IL-1及TNFa含量比較(pg/mL)

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生、骨關(guān)節(jié)病，是一種慢性進行性骨關(guān)節(jié)疾病，好發(fā)于老年。據(jù)流行病學資料統(tǒng)計顯示［7］，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢，目前美、英國家患有膝關(guān)節(jié)炎的比例為5%～10%，與心血管和創(chuàng)傷疾病位列前三位，故了解骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制，是目前研究的熱點和重點。

中醫(yī)學研究顯示［8-9］，骨關(guān)節(jié)炎是痹癥中的一種特殊類型，但與風寒濕痹不盡相同，其致病機制復(fù)雜，既有人體自然衰老所致的肝腎虧損、氣血兩虛等生理因素，又有外感風寒濕邪、慢性損傷等因素。目前研究顯示，“化痰消瘀”為治痹的關(guān)鍵，痰瘀兼驅(qū)方可奏效，祛痰可助化瘀。

現(xiàn)代藥理學研究顯示［10］，制南星、制川烏、薏苡仁、刺五加、丹參、地龍等聯(lián)合組方可促進微循環(huán)，降低血液黏稠度和血小板及紅血球凝集性，溶解血栓而改善血液流變學，從而改善微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓力，恢復(fù)骨關(guān)節(jié)供血，有利于骨關(guān)節(jié)的修復(fù)。

本組研究建立實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型，采用化瘀除濕法進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀除濕法組軟骨細胞凋亡指數(shù)小于模型組(P＜0.05);而化瘀除濕法組的增殖細胞核抗原(PCNA)表達要高于其他各組(P＜0.05)。

目前研究報道稱［11］，關(guān)節(jié)滑膜細胞及軟骨細胞自身在受到不同損傷或炎癥時可產(chǎn)生大量細胞因子，這些因子加速了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。本組研究對各組大鼠干預(yù)后關(guān)節(jié)液中的IL-1和TNFa水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化痰除濕法組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1、TNFa的含量均較對照組顯著升高(P＜0.05)，說明祛痰除濕法可能通過影響膝關(guān)節(jié)軟骨中IL-1、TNF-a的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)，延緩關(guān)節(jié)軟骨細胞的退變。

綜上所述，化痰除濕法顯著減少兔早期膝關(guān)節(jié)實驗性O(shè)A軟骨細胞的凋亡，促進軟骨細胞的增殖，對早期骨關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。

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Effect of Removing Phlegm and Dampness Method on Apoptosis of Chondrocytes in Early Experimental Osteoarthritis

YANG Yu-guo1，YANG Jin-suo2
(Nanyang Medical High College，Henan Province，Nanyang 473061，China)

Objective:To study the Huatan Chushi Quyu preparation on cartilage cells apoptosis in Experimental with osteoarthritis.Methods:Selected 40 healthy Wistar rats，weighing(250±10)g，male and female，according to figures random method 80 rats were divided into Group A Huatan Chusi method in group B as positive control group，group C as a model group，D group was the blank control group in each group 20.All rats were using modified Hulth modeling method modeling experiments，the formation of osteoarthritis model，the first 4 weeks of administration，four weeks after the intervention from rat knee cartilage morphology was observed by light microscopy，in situ end labeling(TUNEL method)，immunohistochemical staining were observed chondrocyte apoptosis and the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)，and measured by radioimmunoassay synovial fluid IL-1，TNFa levels.Results:Chondrocyte apoptosis index of Hatan Chushi method group is smaller than the model group;while PCNA expression in Hutan Chushi method group than the other groups;synovial fluid of rats in Hutan Chushi method group IL-1，TNFa levels were significantly higher than the other groups.Conclusions:Huatan Chushi method significantly reduces OA chondrocytes apoptosis in Rat knee in early stage，promote the proliferation of chondrocytes，have a better therapeutic effect early osteoarthritis.

Osteoa is higher rthritis;chondrocytes;apoptosis;Hantan Chushi Method

R684.3

B

1006-3250(2015)06-0665-03

2015-03-05

楊雨果(1979-)，男，醫(yī)學碩士，從事中醫(yī)骨傷學的臨床與研究。