劉志會

[摘 要] 目的：建立高效液相法測定土霉素含量的方法。方法：采用Agilent-C18 （4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相：醋酸銨溶液-乙腈（85∶15）；檢測波長：280nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃。結(jié)果：土霉素在0.12-9.6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999，平均回收率為99.2%，RSD=0.6%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便、準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用土霉素片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；土霉素；含量測定

[中圖分類號]R927.2 [文獻標志碼] A [文章編號]1007-8517（2015）06-0010-02

土霉素是多環(huán)并四苯酸基酰胺母核的衍生物，為一種廣譜抗菌素，臨床上主要用于革蘭陽性菌、陰性菌感染，以及立克次體病、衣原體病、支原體病、螺旋體病的治療。目前土霉素片的含量測定方法為中國藥典規(guī)定的抗生素微生物檢定法，收載于衛(wèi)生部藥品標準·抗生素分冊（第一冊）。該方法檢驗周期長、操作繁瑣、影響因素多、易造成誤差，且不能滿足批量生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要。筆者采用高效液相色譜法取代效價法測定土霉素片的含量，其檢驗周期短、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津）；LC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津）；梅特勒AG-135型電子天平；梅特勒TOLEDO型酸度計（精度：0.01pH單位）； KQ-5200E型超聲波清洗器。

1.2 材料 土霉素對照品（批號：130487-200302，含量：88.2%，中國藥品生物制品檢定所）；土霉素片（批號：140113、140118、140105，規(guī)格：0.25g）；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：AgilentTM-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相：醋酸銨溶液[0.25mol/L醋酸銨溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺（100∶10∶1），用醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.5]-乙腈（85∶15）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：280nm；進樣量：10μl。理論塔板數(shù)按四環(huán)素峰計算應(yīng)不低于3000，四環(huán)素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合中國藥典2010年版二部附錄VD規(guī)定（不低于1.5）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定土霉素對照品30.31mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液稀至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取土霉素片10片，精密稱定，平均片重0.3578g，研細，精密稱取0.3647g（約相當于土霉素0.25g），置于500ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 色譜測定 分別精密量取對照品溶液（約0.1mg/ml）和供試品溶液（約0.1mg/ml）各10μl ，注入液相色譜儀測定，即得。見圖1、2。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密量取土霉素對照品溶液（0.1mg/ml）10μl，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，RSD為0.1%，說明精密度良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取上述土霉素對照品溶液（0.1mg/ml），分別精取 1、3、5、10、20、40、60、80μl，注入液相色譜儀（自動進樣），記錄峰面積。以進樣量對峰面積進行回歸，得回歸方程：Y=213450X-89963，r=0.9999。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品（批號：140118），分別于0、3、5、7、10、12、15、20、24、30h測定，結(jié)果RSD為0.3%，表明樣品在30h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品（批號：140118），依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定峰面積，計算土霉素含量。結(jié)果測得平均含量為95.7%，RSD為0.12%（n=6），表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 精密稱取已知含量（670.34mg/g）的樣品6份，配置成所需濃度，和標準品溶液（0.53447mg/ml），各5ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。平均回收率99.2%，RSD=0.6%。結(jié)果見表1。

2.4.6 樣品的含量測定 取三批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法計算含量，結(jié)果批號為140113、140118、140105的土霉素樣品結(jié)果為95.6%、95.9%、95.5%。按微生物檢定法測定三批樣品結(jié)果為95.1%、95.2%、95.0%。

3 討論

在實驗中如果遇到土霉素主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離效果不能滿足實驗要求，可以減少乙腈的比例，改變流動相的極性，使土霉素主峰的保留時間延長，達到其與雜質(zhì)峰分離的目的，具體改變多少，依據(jù)實驗條件反復(fù)摸索而定。

由試驗結(jié)果可知，該方法簡單、快捷、重現(xiàn)性好、靈敏度高，測定結(jié)果與微生物檢定法相吻合，并可批量檢測，可用于土霉素含量的質(zhì)量控制。

參考文獻

[1] WS1-C2-0007-89，四環(huán)素片[S].中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準.抗生素藥品（第一冊），1989.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：635-636.