劉 超梅麗寶張紹龍張家寶謝祖宏楊 志劉芝蘭

（1.保山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南保山678000；2.云南大學(xué)，云南昆明650091；3.武漢大學(xué)，湖北武漢430072）

全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定紫皮石斛中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

劉 超1梅麗寶1張紹龍1張家寶1謝祖宏1楊 志2劉芝蘭3

（1.保山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南保山678000；2.云南大學(xué)，云南昆明650091；3.武漢大學(xué)，湖北武漢430072）

建立了以凝膠滲透色譜（GPC）和固相萃?。⊿PE）凈化、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法同時(shí)測(cè)定紫皮石斛中10種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。樣品用乙腈超聲提取，提取液經(jīng)GPC去除類脂雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，后經(jīng)Envi-Carb/NH2固相萃取柱凈化，選擇離子（SIM）監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。在26min內(nèi)10種農(nóng)藥得到很好的分離，農(nóng)藥殘留量在0.02～0.5μg/mL，方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.997 3～0.999 9，農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.05mg/kg和0.2mg/kg時(shí)，加標(biāo)回收率在70.4%～115.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.8%～9.6%，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，檢出限為0.005 2～0.011mg/kg。方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，能夠運(yùn)用于石斛中多組分有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

凝膠滲透色譜；固相萃取；氣相色譜-質(zhì)譜法；紫皮石斛；有機(jī)磷農(nóng)藥

0 前言

石斛屬（Dendrobium）是蘭科植物中第二大屬，全世界約有1 400種，我國(guó)約有76種，具有“益胃生津、滋陰清熱”的功效［1-4］，作為“食藥同源、以食為主、開發(fā)多元、前景廣闊”的農(nóng)副、林業(yè)和生物藥用資源產(chǎn)品，越來越受到消費(fèi)者的青睞和追捧。為了提高病蟲害的防治效果，農(nóng)藥已廣泛應(yīng)用于石斛生產(chǎn)種植中，從而引起石斛農(nóng)殘超標(biāo)，并且隨著人們對(duì)食品安全重視的不斷提高，加強(qiáng)石斛及其產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)和控制已成為社會(huì)發(fā)展的需要。

目前對(duì)中草藥等保健食品的農(nóng)殘檢測(cè)已有相關(guān)報(bào)道［5-8］，但針對(duì)石斛農(nóng)殘的檢測(cè)方法報(bào)道較少［9］。本文根據(jù)國(guó)家農(nóng)殘限量［10］和當(dāng)?shù)厥袡C(jī)磷農(nóng)藥使用情況，采用全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定石斛中敵敵畏、甲拌磷、樂果等10種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，能夠運(yùn)用于石斛中多組分有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent科技有限公司）：7890A-5975C，配有電子轟擊離子源（EI）；HP-5毛細(xì)管色譜柱（30m×0.320μm×0.2μm，美國(guó)Agilent科技有限公司）；PrepElite-Gvs全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取系統(tǒng)（美國(guó)Labtech有限公司）；Bio-Beads SX3凝膠色譜柱（20mm×300mm i.d，美國(guó)Labtech有限公司）；MS205DΜ電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；AS3120超聲儀（北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：敵敵畏、甲拌磷、樂果、毒死蜱、倍硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對(duì)硫磷、喹硫磷、三唑磷購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，濃度均為100μg/mL。

環(huán)己烷、乙腈、丙酮為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；乙酸乙酯（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；氯化鈉、無水硫酸鈉為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無水硫酸鈉在650℃下灼燒4h，置于干燥器中備用。Carb/NH2固相萃取小柱（500mg/6mL，美國(guó)Agilent科技有限公司）。

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為二次去離子水。

紫皮石斛樣品采自云南省龍陵縣龍山鎮(zhèn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以丙酮為溶劑，依次吸取上述10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各500μL于50mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，制成濃度為1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級(jí)稀釋，配制成濃度為0.02，0.08，0.16，0.32，0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 試樣的提取

將石斛鮮條切碎，放入樣品粉碎機(jī)中攪碎，制成試樣。稱取10.0g攪碎的樣品，置于100mL具塞三角錐形瓶中，加入50mL乙腈，超聲提取45min（每5min震搖一次），然后用濾紙將濾液過濾到預(yù)先裝有5g氯化鈉的50mL具塞量筒中，收集濾液40mL，蓋上塞子，激烈震蕩1min，靜置，使乙腈和水相分層，然后吸取20.0mL乙腈溶液于50mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)近干，加入5.0mL環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1∶1）溶解，待凈化。

1.2.3 樣品的凈化

將預(yù)先用丙酮淋洗過的Carb/NH2固相萃取小柱安裝于固相萃取裝置中，把上述濃縮液轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取系統(tǒng)的樣品瓶中，按照1.3.1設(shè)定的條件進(jìn)行凈化，最后過0.22μm的有機(jī)濾膜，濾液供GC-MS分析。

1.2.4 測(cè)定

待儀器穩(wěn)定后，在選定的儀器操作條件下，依次準(zhǔn)確吸取1.0μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（或處理后的樣品溶液）注入GC-MS儀中，以保留時(shí)間和離子豐度比定性，以單離子外標(biāo)法定量。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取條件

GPC條件：用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1∶1）作為流動(dòng)相，柱溫40℃，進(jìn)樣量2mL，流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，定時(shí)收集5～15min洗脫液。

第一次濃縮條件：加熱溫度50℃，氮吹時(shí)間20min，蒸干時(shí)間1min，消霧時(shí)間0.5min，置換溶劑丙酮，定容體積2.0mL。

SPE條件：洗脫溶劑丙酮，注入體積10.0mL，流速3.0mL/min。

第二次濃縮條件：加熱溫度50℃，氮吹時(shí)間10min，蒸干時(shí)間1min，消霧時(shí)間0.5min，置換溶劑丙酮，定容體積2.0mL。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件

2 結(jié)果和討論

2.1 提取溶劑的確定

根據(jù)有關(guān)方法［11-12］以及相關(guān)文獻(xiàn)［13-15］報(bào)道，農(nóng)殘檢測(cè)使用較多的提取溶劑有乙酸乙酯、石油醚、丙酮等。通過實(shí)驗(yàn)研究，丙酮作為提取溶劑時(shí)，樣品中溶出的色素和雜質(zhì)多，乙腈提取時(shí)，溶出的雜質(zhì)少、后處理簡(jiǎn)便，因此，實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑。

2.2 凝膠色譜條件的確定

凝膠滲透色譜是依據(jù)樣品分子量大小進(jìn)行分離，色素、多糖等分子量大的物質(zhì)先流出色譜柱，分子量小的農(nóng)藥后流出色譜柱。吸取1.0μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜儀，用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1∶1）洗脫，根據(jù)紫外色譜圖的變化情況，分段收集流出液，進(jìn)行GC-MS定性檢測(cè)，確定收集時(shí)間。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過全掃描（SCAN）獲得混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖（TIC），根據(jù)總離子流圖中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)荷比（m/z），確定選擇離子掃描（SIM）模式下的分析條件。10種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子、定性離子及豐度比見表1。

2.4 校準(zhǔn)曲線及其相關(guān)性

按照實(shí)驗(yàn)所確定的分析條件，10種有機(jī)磷農(nóng)藥得到了很好的分離（見圖1）。同時(shí)以色譜峰的保留時(shí)間和離子相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致程度來進(jìn)行定性確證，相對(duì)豐度比大于50%時(shí)，允許偏差±10%；相對(duì)豐度比范圍在20%～50%時(shí)，允許偏差±15%；相對(duì)豐度比范圍在10%～20%時(shí)，允許偏差±20%；相對(duì)豐度比小于10%時(shí)，允許偏差±50%。定量測(cè)定時(shí)，以農(nóng)藥的濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，選擇離子峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，10種農(nóng)藥在0.02～0.5μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.997，結(jié)果詳見表1。

表1 10種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量和定性離子等相關(guān)參數(shù)Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions，of 10organophosphorous pesticides

2.5 方法的加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)

在紫皮石斛空白樣品中分別添加0.05mg/kg和0.2mg/kg的混合有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法提取、凈化，每一水平平行測(cè)定6次，獲得的選擇離子流色譜圖按信噪比3倍（S/N＝3）條件計(jì)算方法的檢出限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在0.05和0.2mg/kg的添加水平，10種有機(jī)磷農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率在70.4%～115.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.6%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，檢出限為0.005 2～0.011mg/kg。詳見表2。

圖1 10種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.4μg/mL）選擇離子流色譜圖Figure 1 SIM chromatogram of 10organophosphorous pesticides standards.

表2 0.05mg/kg和0.2mg/kg加標(biāo)水平下10種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率、精密度和檢出限Table 2 Recoveries，precisions and detection limits of 10organophosphorous pesticides at 0.05mg/kg and 0.2mg/kg spiked levels（n＝6）

2.6 實(shí)際樣品的分析

運(yùn)用建立的方法對(duì)采集的20份紫皮石斛樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，其中2份樣品檢出毒死蜱，1份樣品檢出殺螟硫磷，其余樣品均未檢出上述農(nóng)藥。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)建立了全自動(dòng)凝膠凈化-濃縮-固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定紫皮石斛中10種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能夠運(yùn)用于石斛中多組分有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

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Determination of Organophosphorous Pesticide Residues in Dendrobium Devoninum Paxt Using Automatic Gel Permeation Chromatography and Solid Phase Extraction by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Chao1，MEI Libao1，ZHANG Shaolong1，ZHANG Jiabao1，XIE Zuhong1，YANG Zhi2，LIU Zhilan3
（1.BaoshanComprehensiveInspectionCentreofQualityandTechnicalSupervision，Baoshan，Yunnan678000，China；2.YunnanUniversity，Kunming，Yunnan650091，China；3.WuhanUniversity，Wuhan，Hubei430072，China）

A novel method has been developed for simultaneous determination of ten organophosphorous pesticide residues in Dendrobium Devoninum Paxt based on automatic gel permeation chromatography（GPC）coupled with solid phase extraction（SPE）-gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The sample was extracted with acetonitrile by ultrasonic extraction.The automatic gel permeation chromatography was used to remove the macromolecule interference material and fat，and then the pigment in the extraction solution was purified by Envi-Carb/NH2solid phase extraction.The qualitative analysis was performed by using mass spectrometric detection in the selected ion-monitoring（SIM）mode under the optimal chromatographic conditions.The external standard method was adopted for quantitative analysis.Ten organophosphorous pesticides were separated from each other within 26minutes，A good linearity was in the range of 0.02～0.5μg/mL with correlation coefficients of 0.997 3～0.999 9.The recoveries ofpesticides at spiked levels of 0.05and 0.2mg/kg were 70.4%～115.8%.The detection limits were 0.005 2～0.011mg/kg with therelative standard deviations（RSDs）of less than 16%.The method is rapid，accurate and sensitive，and can meet the demand of determining organophosphorous pesticide residues in Dendrobium.

gel permeation chromatography（GPC）；solid phase extraction（SPE）；gas chromatographymass spectrometry（GC-MS）；Dendrobium Devoninum Paxt；organophosphorous pesticides

O657.63；TH843

A

2095-1035（2015）04-0008-05

2015-04-29

2015-07-01

云南省保山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015025）資助

劉超，男，助理工程師，主要從事產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究。E-mail：chaoliu2003＠163.com

10.3969/j.issn.2095-1035.2015.04.003