桂 巖，張小兵，江 英，王有虎，張福宏，劉翔毅，馬 毅，董 明，楊貴軍

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

18β-甘草次酸長期灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)的影響*

桂 巖1，張小兵1，江 英1，王有虎1，張福宏1，劉翔毅2，馬 毅1，董 明1，楊貴軍1

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察18β-甘草次酸長期灌胃對正常大鼠肝臟功能及組織形態(tài)的影響。方法：將120只大鼠(雌雄各半)隨機分成正常對照組和甘草次酸低劑量(25μg/g )、中劑量(50 μg/g)、高劑量組(100μg/g) 4組。每組分別以相應(yīng)劑量甘草次酸灌胃，于給藥6周、14周、22周、30周及停藥4周檢測大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬甘酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、清蛋白、球蛋白、總蛋白、膽紅素及堿性磷酸酶等指標(biāo)，以及肝臟臟器指數(shù)和組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：干預(yù)6周、14周、22周、30周及停藥4周,甘草次酸低、中、高劑量組與正常對照組轉(zhuǎn)氨酶、清蛋白、膽紅素及堿性磷酸酶對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而球蛋白和總蛋白在給藥30周及停藥4周時均低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但3個劑量組之間對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在各觀測時間點，各組間大鼠肝臟組織形態(tài)未見明顯改變,肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝索排列整齊、肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。結(jié)論：不同劑量甘草次酸長期灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)無顯著影響，但長期用藥可因其免疫抑制作用而致球蛋白降低。

18β-甘草次酸；肝功能；肝臟組織形態(tài)；動物；大鼠

甘草屬豆科植物,性平味甘，有祛痰止咳、補脾益氣、清熱解毒、調(diào)和諸藥之功效，可與金銀花、連翹等配伍用于癰疽瘡瘍、咽喉腫痛；與白術(shù)、黨參等配伍成理中丸，用于脾氣虛；與黃精、白芷等配伍成黃白甘草湯，用于脾虛血燥型剝脫性唇炎[1]；與芍藥等配伍，用于風(fēng)熱型過敏性紫癜等[2]；與黃芪、黨參及白術(shù)等藥物配伍制成加味玉屏風(fēng)散，用于脾肺虛寒型變應(yīng)性鼻炎等[3]。此外，甘草還具有調(diào)和之效，能緩解大黃、芒硝等烈性藥對胃腸道的強烈刺激。甘草的有效成分甘草酸在體內(nèi)水解掉2分子葡萄糖醛酸后形成甘草次酸[4]。甘草次酸有良好的生理活性、生物相容性和較低的不良反應(yīng)，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗?jié)?、抗氧化、降血脂、?zhèn)咳、改善胰島素抵抗以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[5-9]。隨著臨床推廣和研究深入，甘草次酸的不良反應(yīng)也得到重視。這方面的報道多見于長期或大量服用甘草酸制劑產(chǎn)生的腎上腺鹽皮質(zhì)樣副作用如水鈉潴留、高血壓等，而長期大劑量甘草次酸灌胃對正常大鼠肝功能以及對肝臟組織形態(tài)的影響尚未見報道。本研究通過不同劑量甘草次酸長期灌胃，觀察其對大鼠肝臟形態(tài)及功能的影響，為甘草次酸的安全劑量及用藥周期提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康Wistar大鼠120只，體質(zhì)量180～220 g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF動物中心提供,動物質(zhì)量編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 試劑與儀器

18β-甘草次酸，500 g/袋，AR級，甘肅泛植生物科技有限公司產(chǎn)品，批號12081603。OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀，產(chǎn)地日本。

1.3 動物分組

將大鼠隨機分為正常對照組、甘草次酸低劑量組(25 μg/g)、中劑量組(50 μg/g)和高劑量組(100 μg/g)4組，每組30只。

1.4 給藥干預(yù)

按照動物體表面積轉(zhuǎn)換計算公式[10]計算給藥量。本實驗中,大鼠體質(zhì)量在180～220 g，按平均值200 g計算。甘草次酸組參照復(fù)方甘草酸苷片臨床用量(每片含甘草酸25 mg，3片/次，3次/日，每日甘草酸總用量225 mg)。低、中、高劑量組每日給藥劑量分別為25，50，100 μg/g ，混于2 mL生理鹽水灌胃；正常對照組以等量生理鹽水替代。

1.5 檢測指標(biāo)

分別于給藥6周、14周、22周、30周及停藥4周，每組隨機取6只大鼠，100 g/L 水合氯醛(3 μL/g)腹腔注射麻醉，剪毛、打開胸腔；心臟采血后立即以40 g/L多聚甲醛50 mL快速心臟灌注；隨即打開腹腔， 取出肝臟，稱量質(zhì)量并計算臟器指數(shù)；以100 g/L 甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片行HE染色；光鏡下觀察組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

采用蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀檢測不同時間點各組大鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、清蛋白、球蛋白、總蛋白、總膽紅素及堿性磷酸酶等肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠AST、ALT含量對比

2.1.1 血清AST

給藥6周時,甘草次酸低、中、高劑量組AST含量與正常對照組對比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，3個劑量組之間的差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此后，隨著干預(yù)時間的延長，在14周、22周、30周時間點，甘草次酸低、中、高劑量組AST含量有升高趨勢，但較正常對照組仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。停藥4周，3個劑量組AST含量較同組30周時有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，各組間差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠血清AST含量對比

表1 各組大鼠血清AST含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組6128．50±27．25143．5±25．88145．75±48．09137．25±46．59136．50±32．13甘草次酸低劑量組6133．75±29．66152．25±41．79159．00±33．11162．50±28．84144．50±25．45甘草次酸中劑量組6126．5±29．89155．25±31．43155．16±28．85172．0±41．56140．71±16．34甘草次酸高劑量組6135．25±31．62172．25±32．62172．50±50．92189．50±113．8144．35±28．58

2.1.2 血清ALT

在各時間點，甘草次酸低、中、高劑量組血清ALT含量組間對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；甘草次酸3個劑量組分別與相應(yīng)時間點的正常對照組對比，差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清ALT含量對比

表2 各組大鼠血清ALT含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組646．17±12．3450．50±16．4353．5±15．7850．25±18．82 47．0±17．19甘草次酸低劑量組641．0±14．7852．0±24．5958．17±29．5751．50±37．5045．50±10．03甘草次酸中劑量組643．33±10．8651．33±14．9856．67±14．6758．50±21．9255．43±7．09甘草次酸高劑量組644．20±16．2754．17±20．4559．33±17．5259．0±13．0257．83±14．91

2.2 各組大鼠血清蛋白含量對比

2.2.1 血清總蛋白

在6周、14周、22周各時間點，甘草次酸低、中、高劑量組組間血清總蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥30周，甘草次酸3個劑量組血清總蛋白均低于正常對照組(P<0.05)。停藥4周后，3個劑量組總蛋白有所回升、但仍低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組之間對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清總蛋白含量對比

表3 各組大鼠血清總蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組671．90±5．6473．73±4．2470．93±4．7771．2±6．4172．8±2．24甘草次酸低劑量組670．40±3．7770．55±2．4568．24±4．2060．20±3．83?64．65±5．06?甘草次酸中劑量組670．85±1．3871．42±4．1270．02±6．8663．05±4．25?65．70±5．16?甘草次酸高劑量組669．58±3．4170．45±3．7870．11±4．8462．27±2．67?62．57±2．96?

注：與正常對照組對比，*P<0.05。

2.2.2 血清清蛋白

在各個觀測時間點，各組間血清清蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清清蛋白含量對比

表4 各組大鼠血清清蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組635．78±5．9837．60±3．1436．27±2．7835．70±5．2436．40±1．12甘草次酸低劑量組635．33±2．7636．47±1．5935．98±3．6434．28±1．8434．77±0．96甘草次酸中劑量組634．13±1．3036．85±1．3536．55±3．0934．98±2．0135．76±2．74甘草次酸高劑量組635．18±1．6236．37±0．8437．32±1．3534．68±1．4434．52±0．43

2.2.3 血清球蛋白

在給藥6周、14周及22周，各組間血清球蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 給藥30周，甘草次酸低、中、高劑量組血清球蛋白含量均低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在停藥4周，3個劑量組血清球蛋白較前無顯著變化、仍低于正常對照組；3組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清球蛋白含量對比

表5 各組大鼠血清球蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組636．13±1．8335．27±3．7234．67±2．4935．5±2．8036．40±1．12低劑量組635．07±1．9234．08±3．8436．86±1．4327．43±2．78?29．88±4．85?中劑量組636．72±2．6134．58±3．7836．47±2．5528．07±2．41?29．94±4．45?高劑量組634．40±3．4134．08±3．0835．46±2．3227．58±2．0?28．05±2．78?

注：與正常對照組對比，*P<0.05。

2.3 各組大鼠血清總膽紅素和堿性磷酸酶含量對比

2.3.1 血清總膽紅素

在各時間點，各組間血清總膽紅素對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同一個劑量組在不同時間點的對比亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組大鼠血清總膽紅素含量對比

表6 各組大鼠血清總膽紅素含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組61．37±0．761．28±0．671．16±0．921．45±0．791．55±0．56甘草次酸低劑量組61．54±10．591．23±0．991．92±0．801．98±0．551．75±0．80甘草次酸中劑量組61．31±0．451．35±1．241．38±0．721．80±1．241．73±0．61甘草次酸高劑量組61．46±1．071．14±0．432．03±0．682．08±0．471．96±0．43

2.3.2 血清堿性磷酸酶

在各時間點，各組間堿性磷酸酶對比，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同一個劑量組在不同時間點的對比亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠血清堿性磷酸酶含量對比

表7 各組大鼠血清堿性磷酸酶含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組6155．0±45．06163．75±72．67178．0±52．98177．75±65．93156．50±40．42甘草次酸低劑量組6145．75±30．23177．25±43．70172．0±80．14152．17±41．05160．85±41．04甘草次酸中劑量組6153．25±28．15176．75±66．77172．17±79．13161．83±42．90169．43±37．59甘草次酸高劑量組6178．5±54．44177．50±33．64189．33±90．74208．50±70．38166．83±39．43

2.4 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

在各時間點，甘草次酸3個劑量組大鼠肝臟組織肉眼觀察未見明顯改變，肝臟臟器指數(shù)與正常對照組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在同一觀測時間點上，低、中、高3個劑量組之間兩兩比較，差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

表8 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

表8 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組64．91±0．454．94±0．585．10±0．565．25±0．975．17±0．89甘草次酸低劑量組65．42±1．045．57±1．025．72±0．676．03±0．795．91±1．13甘草次酸中劑量組65．44±0．665．36±0．765．84±0．366．21±1．035．89±0．69甘草次酸高劑量組65．75±1．125．65±0．875．98±0．796．11±0．796．14±0．86

2.5 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變

正常對照組大鼠肝臟切片HE染色光鏡下可見：肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇清晰,肝索排列整齊，肝細(xì)胞完整、排列規(guī)則(圖1)。給藥6周時，甘草次酸低、中、高劑量組肝臟組織HE染色見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤，無纖維增生，無細(xì)胞水腫，門管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈及小葉間膽管結(jié)構(gòu)完整無擴張(圖2a～2c)。此后，隨著甘草次酸的持續(xù)干預(yù)，在14周及22周時間點，3個劑量組大鼠肝臟組織形態(tài)無明顯變化(圖3a～3c,圖4a～4c)。直至給藥終點(第30周)，低、中、高劑量組肝臟未見顯著病理改變，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索排列整齊，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，門管區(qū)內(nèi)小葉間動脈，小葉間靜脈和小葉間膽管規(guī)則(圖5a～5c)。停藥4周后，低、中、高劑量組肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察與正常對照組無顯著差異：肝小葉完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)完整、以中央靜脈為中心呈放射狀排列(圖6a～6c)。

圖1 肝臟組織(HE，×200)

3 討 論

18β-甘草次酸的五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)使其具有糖皮質(zhì)激素樣作用而無嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床，如用于各種急慢性肝炎、肝纖維化、肝癌等疾病。此外，它還具有防癌、抗癌、誘導(dǎo)干擾素、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等作用[11]。甘草次酸的類激素樣作用通過兩個途徑實現(xiàn)：甘草次酸作為甾體激素代謝失活酶抑制劑，可抑制Ⅰ型11β-羥化甾體脫氫酶(Ⅰ型11β-HSD)、Ⅱ型11β-HSD、3HSD及17HSD等，使體內(nèi)皮質(zhì)激素代謝減少從而提高內(nèi)源性和外源性皮質(zhì)激素的含量[5,12-13]；此外，由于甘草次酸具有類似于甾體激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，故可作為配體直接與皮質(zhì)激素受體結(jié)合[5,14-15]。

機體內(nèi)多個臟器組織均存在甘草次酸的特異性結(jié)合位點，肝臟的甘草次酸結(jié)合位點活性最高，甘草次酸與肝細(xì)胞膜上該位點的結(jié)合具有高度特異性及可飽和性[16]，此是甘草次酸用于臨床多種肝臟疾病治療的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Rahman[17]以醋酸鉛誘導(dǎo)建立肝癌大鼠模型，發(fā)現(xiàn)甘草酸可顯著降低AST和ALT等轉(zhuǎn)氨酶水平，并提高還原型谷胱甘肽及其相關(guān)酶類的水平。Kazuk等[18]報道了甘草酸可顯著抑制LPS和D-半乳糖苷兩種小鼠肝損傷模型中ALT和AST的增加。Lee等[19]發(fā)現(xiàn)在小鼠四氯化碳肝損傷模型中，甘草次酸可顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α及丙二醛水平。

在肝臟疾病治療中，甘草次酸改善肝功能、降低轉(zhuǎn)氨酶及升高清蛋白的療效已得到大量的實驗驗證及臨床病例證實?；诟什荽嗡岬母闻K靶向特點，可以推測甘草次酸對正常大鼠肝細(xì)胞也可能產(chǎn)生保護作用或不良反應(yīng)，甚至毒副作用。本實驗給正常大鼠以甘草次酸灌胃，在加大甘草次酸劑量(正常劑量的5倍、10倍、20倍)及延長用藥時間(30周)雙因素作用下，血清轉(zhuǎn)氨酶、清蛋白、堿性磷酸酶及膽紅素未見顯著升高；用藥至30周時，各組間ALT水平差別仍無統(tǒng)計學(xué)意義，AST有小幅度上升(最高值：30周時高劑量組為189.50±113.88 U/L)，但與正常對照組(137.25±46.59U/L)對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義,尚可認(rèn)為轉(zhuǎn)氨酶無顯著升高。而 AST的升高趨勢，推測是由于甘草次酸促進(jìn)了肝細(xì)胞線粒體的滲透轉(zhuǎn)運，線粒體中的AST釋放至胞質(zhì)。Salvi[20]報道甘草次酸可導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體腫脹、滲透性轉(zhuǎn)變，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子釋放；此后該作者還報道了甘草次酸的衍生物甘珀酸同樣具有類似作用[21]。Cristina等人通過大鼠肝細(xì)胞線粒體體外干預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)：甘草次酸通過與線粒體呼吸鏈相互作用、產(chǎn)生過氧化氫并氧化硫醇基和內(nèi)源性嘧啶核苷酸，從而導(dǎo)致線粒體過渡孔開放，推測是甘草次酸C-11位上的羧基與線粒體復(fù)合物I的F/S中心相結(jié)合，形成一個以氧為中心的自由基而產(chǎn)生促氧化反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示：血清清蛋白未見明顯變化,但血清球蛋白具有降低趨勢，即在6周、14周及22周時，均可觀察到甘草次酸干預(yù)組較正常對照組減低，但差別尚無統(tǒng)計學(xué)意義；而在用藥30周后干預(yù)組球蛋白水平顯著低于正常對照組；即使停藥4周后，這種差異仍然顯著、具有統(tǒng)計學(xué)意義。血清總蛋白的變化與球蛋白相一致。球蛋白由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，包括免疫球蛋白和補體、多種糖蛋白、金屬結(jié)合蛋白、多種脂蛋白及酶類，一般可分為α1、α2、β、γ 4種成分。球蛋白與機體免疫功能、血漿黏度密切相關(guān)。Haggag[22]發(fā)現(xiàn)甘草的提取物甘草酸可顯著抑制小鼠哮喘模型中IgE的表達(dá)、減少組胺釋放。Kimura[23]報道了β-甘草次酸對補體活化的直接抑制作用并降低循環(huán)免疫復(fù)合物水平。在本研究中，給藥至22周時球蛋白尚無顯著降低，直至給藥30周時才明顯低于正常對照組，這與長期應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素所導(dǎo)致的球蛋白合成減少一致，也側(cè)面顯示了甘草次酸的類腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，提示在長期的治療過程中應(yīng)注意其免疫抑制作用可能會導(dǎo)致球蛋白低于正常值而影響機體的免疫功能。

本實驗中，各組間大鼠肝臟組織未見明顯的形態(tài)學(xué)差異，至用藥30周時，甘草次酸低、中、高劑量組肝索排列整齊規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，肝細(xì)胞完整、無水腫及壞死，門管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管管腔無擴張或狹窄，管壁無水腫。結(jié)合肝臟組織形態(tài)及肝功能指標(biāo)的表現(xiàn)，可以認(rèn)為在30周給藥時間內(nèi)給予較大劑量(25 μg/g，50 μg/g，100 μg/g)甘草次酸灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)無顯著毒副作用，提示甘草次酸的用藥劑量及用藥時間有較大的安全空間可供選擇。但需要重視的是：個體對甘草次酸的敏感性差異很大。Stφrmer[24]報道：在健康人群中，對甘草次酸敏感性高者每日口服100 mg甘草次酸即可出現(xiàn)不良反應(yīng)，而大多數(shù)人每日口服量達(dá)400 mg仍無明顯異常表現(xiàn)。

雖然本實驗尚未發(fā)現(xiàn)甘草次酸對正常大鼠肝臟的明顯毒副作用，但大劑量甘草次酸引起全身其他臟器損害的報道較多見，如腎損害、高血壓、水鈉潴留及低鉀血癥等[25-26]。為進(jìn)一步了解甘草次酸的不良反應(yīng)，需結(jié)合個體敏感性、全身各臟器組織形態(tài)及功能進(jìn)行綜合評估，為臨床用藥提供更詳實、可靠的數(shù)據(jù)支持，以期充分發(fā)揮祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的優(yōu)勢，開發(fā)其巨大的藥用潛質(zhì)。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0062-06

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.32

張小兵，教授，主任醫(yī)師，790736924@qq.com

國家自然科學(xué)基金項目(81160449)

2014-09-01；

2014-11-24