趙 靜，于 鴻，吳 荻，史衛(wèi)國(guó)，仲伯華，劉 菁，張馨月，趙大瑋，王學(xué)林

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130062；

2.吉林省腫瘤防治研究所細(xì)胞生物研究室，吉林長(zhǎng)春130012；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林長(zhǎng)春130021；

4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；5.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長(zhǎng)春130022；6.吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺科，吉林長(zhǎng)春130012）

新型伊立替康衍生物ZBH－1208的體外抗腫瘤活性及機(jī)制研究

趙 靜1＊，于 鴻2＊，吳 荻3，史衛(wèi)國(guó)4，仲伯華4，劉 菁1，張馨月5，趙大瑋6，王學(xué)林1

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130062；

2.吉林省腫瘤防治研究所細(xì)胞生物研究室，吉林長(zhǎng)春130012；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林長(zhǎng)春130021；

4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；5.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長(zhǎng)春130022；6.吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺科，吉林長(zhǎng)春130012）

目的研究新型伊立替康衍生物ZBH－1208體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并初步探討其作用機(jī)制。方法采用四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測(cè)分析ZBH－1208對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人小細(xì)胞肺癌NCI－H446細(xì)胞、人乳腺癌MCF－7細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞、人胃腺癌SGC－7901細(xì)胞、人肝癌SMMC－7721細(xì)胞及人胚腎293細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算IC50值；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZBH－1208對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及活化Caspase－3表達(dá)的影響。結(jié)果ZBH－1208對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，呈劑量－時(shí)間依賴關(guān)系。ZBH－1208作用各腫瘤細(xì)胞后IC50值在0.002μmol／L－0.265μmol／L之間，而對(duì)照組伊立替康（CPT－11）的IC50值在0.464μmol／L－52.111μmol／L之間，兩者相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ZBH－1208誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2／M期阻滯，百分比到達(dá)90%以上；并且誘導(dǎo)活化形式Caspase－3表達(dá)增加。結(jié)論與CPT－11相比，新型化合物ZBH－1208具有高效低毒、起效快的特點(diǎn)，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

伊立替康；衍生物；細(xì)胞周期阻滯；細(xì)胞凋亡

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0181）

喜樹堿（Camptothecin，CPT）是美國(guó)化學(xué)家Wall ME和Wani MC在1966年首先從中國(guó)珙桐科植物喜樹（Camptothecaacμminata）中提取，對(duì)多種實(shí)體瘤具有治療作用的天然生物堿［1］。天然喜樹堿水溶性極差，限制了其開發(fā)應(yīng)用。1983年日本Yakult和Painichi公司研制出水溶性好的喜樹堿類衍生物伊立替康（Irinotecan，CPT－11）。CPT－11是7－乙基－10－羥基喜樹堿（SN－38）的一種水溶性前藥，改善了喜樹堿水溶性差的問題，有利于喜樹堿的胃腸道吸收，臨床上用于治療結(jié)腸直腸癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌和惡性淋巴瘤等惡性腫瘤［2］。然而，CPT－11在體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)，必須由羧酸酯酶催化轉(zhuǎn)化為活性形式SN－38，其效率較低，而且CPT－11對(duì)乙酰膽堿酯酶（AchE）具有抑制作用，會(huì)引起嚴(yán)重的毒副作用，如腹瀉和骨髓抑制［3，4］。因此，此類型喜樹堿前藥有待進(jìn)行進(jìn)一步研究開發(fā)。近年來國(guó)內(nèi)外已報(bào)道多種新型改構(gòu)化合物，可以克服伊立替康的缺陷，降低毒副反應(yīng)，提高藥物療效［5－9］。本研究通過分析喜樹堿類衍生物的構(gòu)效關(guān)系和選擇合適的載體，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造與修飾，合成了一系列新型伊立替康衍生物。初步的體外實(shí)驗(yàn)已表明，新型化合物具有高于伊立替康的體外抗腫瘤作用，可以更快的水解為SN－38或以SN－38為母體、水溶性高并能克服伊立替康對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制作用導(dǎo)致的毒副作用，同時(shí)增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤的靶向性。

本文報(bào)道的ZBH－1208是我們挑選的一個(gè)代表性的化合物，實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定ZBH－1208對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株的體外生長(zhǎng)抑制作用，并以人結(jié)腸腺癌SW1116細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究藥物對(duì)SW1116細(xì)胞周期和凋亡的影響，初步探討藥物作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入的體內(nèi)外研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司；RIPA細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自Roche公司；Caspase－3抗體、β－actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz公司；PARP抗體購(gòu)于Abcam公司；COULTER○RDNA PREPTMReagents Kit購(gòu)自Beckman Coulter公司；FITC Active Caspase－3Apoptosis Kit為BD公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞株及受試藥物

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人小細(xì)胞肺癌NCI－H446細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人胃腺癌SGC－7901細(xì)胞、人乳腺癌MCF－7細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞、人肝癌SMMC－7721細(xì)胞及人胚腎293細(xì)胞株均由吉林省腫瘤研究所提供。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基中，0.25%胰酶消化傳代。伊立替康（CPT－11）、SN－38、ZBH－1208由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所設(shè)計(jì)合成并提供。藥物由DMSO溶解至100mmol／L，IMDM培養(yǎng)基稀釋，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MTT法檢測(cè)ZBH－1208的體外抗腫瘤活性

7種腫瘤細(xì)胞株（HeLa、A549、MCF－7、SW1116、NCI－H446、SGC－7901、SMMC－7721）和人正常二倍體293細(xì)胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×104個(gè)／ml接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加藥。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組，DMSO溶劑對(duì)照組，CPT－11陽(yáng)性對(duì)照組和ZBH－1208組。藥物濃度依次為0.0032μmol／L、0.016μmol／L、0.08μmol／L、0.4μmol／L、2μmol／L、10μmol／L、50μmol／L，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為5mg／ml的MTT 20μl，作用4h后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，輕微振蕩使甲瓚充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定492nm波長(zhǎng)處的各孔吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算ZBH－1208和CPT－11對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，采用回歸方程計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

腫瘤細(xì)胞抑制率（%）＝1－［（實(shí)驗(yàn)組OD均值－空白對(duì)照組OD均值）／（細(xì)胞對(duì)照組OD均值－空白對(duì)照組OD均值）］×100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZBH－1208對(duì)SW1116細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5.0×105個(gè)／ml，接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后加入ZBH－1208、CPT－11、SN－38，藥物終濃度均為25μmol／L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞至離心管中，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞在流式上樣管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)／ml。按照DNA Prep Reagents Kit說明書，每管加入100μl DNA Prep LPR，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)1min。加入1ml DNA Prep Stain，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15－20min。300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)（Beckman Coulter Epics XL／MCL），Multi－Cycle軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZBH－1208對(duì)腫瘤細(xì)胞的活化Caspase－3表達(dá)的影響

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105個(gè)／ml，接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后加入ZBH－1208、CPT－11、SN－38，終濃度均為25 μmol／L。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h后收獲各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后重懸細(xì)胞在500μl BD Cytofix／Cytoperm solution中，冰上孵育20min，1000rpm離心5min，棄上清。每個(gè)樣本用100μl BD Perm／Wash buffer和5μl FITC Caspase－3抗體重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30min。300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活化Caspase－3表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件，student－t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異，P＞0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 ZBH－1208的體外抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)選擇的靶細(xì)胞來源于宮頸癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和肝癌等有代表性的實(shí)體瘤并選擇一個(gè)正常二倍體293細(xì)胞作為正常細(xì)胞對(duì)照比較藥物對(duì)正常細(xì)胞的作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZBH－1208、CPT－11作用細(xì)胞48h后，ZBH－1208和CPT－11均可顯著抑制各腫瘤細(xì)胞增殖并呈濃度和時(shí)間依賴性。ZBH－1208對(duì)HeLa、A549、MCF－7、SGC－7901、NCI－H446和SW1116細(xì)胞均顯示出了較CPT－11更強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖的能力（圖1），IC50值在0.002μmol／L－0.265μmol／L之間，CPT－11的IC50值在0.464μmol／L－52.111μmol／L之間，特別是ZBH－1208作用人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞后其IC50值僅為CPT－11的1／600（表1），表明ZBH－1208對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用高于CPT－11。值得注意的是，ZBH－1208對(duì)293細(xì)胞的殺傷作用明顯低于CPT－11，這表明設(shè)計(jì)合成的新化合物具有高效低毒的特性。

表1 ZBH－1208和CPT－11作用后腫瘤細(xì)胞IC50比較

圖1 不同濃度ZBH－1208和CPT－11對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用比較

2.2 ZBH－1208誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

CPT－11作為臨床一線抗腫瘤藥物通過影響細(xì)胞周期，使其不能進(jìn)行正常的有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用終濃度為25μmol／L的ZBH－1208作用于SW1116細(xì)胞48h后，結(jié)果顯示ZBH－1208誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ZBH－1208、CPT－11和SN－38作用SW1116細(xì)胞48h后，各組細(xì)胞中G2／M期細(xì)胞的百分比顯著增加，同時(shí)G0／G1期細(xì)胞數(shù)顯著降低。SN38的作用后，G2／M期細(xì)胞數(shù)目百分比在各組中最高，CPT－11次之，S期和G2／M期細(xì)胞比例明顯升高，ZBH－1208處理后，SW1116細(xì)胞的細(xì)胞周期顯著阻滯于G2／M期，百分比到達(dá)90%以上，其作用與SN38相當(dāng)，明顯優(yōu)于CPT－11（圖2）。

圖2 藥物對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

2.3 ZBH－1208對(duì)SW1116細(xì)胞活化Caspase－3表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶Caspase家族執(zhí)行的胞內(nèi)自殺程序，Caspase－3作為Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制的關(guān)鍵組成部分，在已知凋亡通路中發(fā)揮核心作用。為了研究ZBH－1208是否誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了藥物作用后SW1116細(xì)胞活化Caspase－3的表達(dá)。終濃度為25μmol／L的ZBH－1208、CPT－11、SN－38和DMSO處理結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞24h、48h、72h后，檢測(cè)結(jié)果顯示，ZBH－1208作用后SW1116細(xì)胞活化Caspase－3表達(dá)的百分比顯著高于對(duì)照組，24h后即可見活化Caspase－3的表達(dá)高于CPT－11，與SN－38相當(dāng)，DMSO溶劑對(duì)照組與不加藥物的空白對(duì)照組相比沒有明顯差異；藥物作用48h后ZBH－1208組活化Caspase－3高于SN－38處理組，低于CPT－11組；藥物作用72h后，三組Caspase－3表達(dá)沒有顯著差異（圖3）。

3 討論

CPT－11作為臨床一線抗腫瘤藥物已得到廣泛應(yīng)用，但因其長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性及嚴(yán)重的毒副作用，在使用劑量上具有一定的限制性［10，11］?；贑PT－11或SN－38結(jié)構(gòu)改造后新合成的化合物有望克服伊立替康的毒副作用。我們的前期研究設(shè)計(jì)合成了一系列CPT－11衍生物并初步評(píng)價(jià)了其藥物特性。本研究選擇其中一個(gè)新化合物ZBH－1208，體外實(shí)驗(yàn)研究藥物抗腫瘤作用的機(jī)制，獲得的結(jié)果表明，ZBH－1208可能作為一種新的癌癥化學(xué)治療劑繼續(xù)深入開發(fā)應(yīng)用。

經(jīng)過體外初步研究，ZBH－1208表現(xiàn)出顯著的生物活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞尤其是胃腸道腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出良好的抑制作用，明顯強(qiáng)于母體化合物CPT－11，IC50值顯著低于CPT－11（P＜0.05），提示我們與ZBH－1208類似的一系列合成的新化合物具有超過CPT－11的作用。實(shí)驗(yàn)選取了七種腫瘤細(xì)胞株對(duì)ZBH－1208的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，ZBH－1208水溶性高，對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用低，可以克服CPT－11的毒副作用，體外抗瘤具有廣譜性，對(duì)各株腫瘤細(xì)胞有較好的生長(zhǎng)抑制作用，抗其抗腫瘤活性高于CPT－11和SN－38，藥物在較低濃度時(shí)即可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制有別于CPT－11和SN－38，可能更多涉及凋亡信號(hào)通路的改變，更深入的藥物作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在真核生物中，細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，G2／M期是細(xì)胞進(jìn)行分裂之前在細(xì)胞周期中表現(xiàn)高度復(fù)雜的關(guān)鍵階段，細(xì)胞周期阻滯在G2／M期，是各種DNA損傷劑表現(xiàn)出的共同細(xì)胞反應(yīng)［12］。通過PI染色使用流式細(xì)胞術(shù)我們觀察到新型化合物ZBH－1208引起細(xì)胞周期阻滯于G2／M期，提示ZBH－1208與母藥CPT－11相似，是作為一種DNA損傷劑殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)ZBH－1208的抗腫瘤作用高于SN38。

圖3 藥物對(duì)活化Caspase－3蛋白表達(dá)的影響

除了控制細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間保持著一種動(dòng)態(tài)平衡是維持自身穩(wěn)定的重要因素［13］，細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞分化成熟過程中普遍存在的途徑，是半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活化，開啟胞內(nèi)自殺的程序［14，15］，一些治療和化學(xué)預(yù)防劑可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡消除癌細(xì)胞。我們通過前期實(shí)驗(yàn)推測(cè)ZBH－1208殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。caspase－3在DNA損傷、修復(fù)、和誘導(dǎo)凋亡過程中扮演著重要的角色［16］，本研究中我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了活化形式caspase－3的表達(dá)隨藥物濃度增高而上調(diào)，表明ZBH－1208可以增加腫瘤細(xì)胞活化caspase－3的表達(dá)水平，提示ZBH－1208可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡且誘導(dǎo)凋亡是通過caspase途徑實(shí)現(xiàn)的。我們?cè)诤罄m(xù)的試驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)一步深入分析，探究藥物作用的確切機(jī)制。

綜上所述，新型化合物ZBH－1208可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來抑制其生長(zhǎng)增殖。本研究對(duì)ZBH－1208的抗腫瘤作用進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)，對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為CPT－11類似物的構(gòu)效關(guān)系研究增添了新的內(nèi)容，為同類化合物的結(jié)構(gòu)修飾、改造和開發(fā)提供了研究思路、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論參考。研究結(jié)果表明合成的新化合物具有進(jìn)一步開發(fā)研究的價(jià)值。

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Study on anti－tumor activity and mechanism of novel Irinotecan derivatives ZBH－1208 in vitro

ZHAO Jing1＊，YU

Hong2＊，WU Di3，et al.（1.Key laboratory for Zoonosis Research，Ministry of Education，Institute of Zoonosis，Jilin University，Changchun 130062，China；2.Cell Biology Laboratory，Jilin Province Tumor Institute，Changchun 130012，China；3.Tumor Center of First Clinical Hospital，Jilin University，Chanchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the inhibition effect on the growth of tumor cells of novel Irinotecan derivatives ZBH－1208in vitro and further probe its anticancer mechanisms.MethodsMTT assay was used to evaluate the preliminary anti－tumor effect of ZBH－1208on A549，NCI－H446，HeLa，SGC－7901，MCF－7，SW1116，SMMC－7721and 293cell lines.Cytotoxicity for the tumor cells was assessed by the tumor cell growth inhibition rates and IC50.Flow cytometry analysis was performed to analyze the expression of Caspase－3and cycle distribution of the tumor cells treated with ZBH－1208.ResultsZBH－1208had significant anti－proliferation effects on A549，NCI－H446，HeLa，SGC－7901，MCF－7，SW1116，SMMC－7721cell lines，and was dependence on concentration and time variant.IC50of seven cancer cell treated with ZBH－1208were significantly lower than that of CPT－11（P＜0.05）.Cell cycle of the tumor cells treated with ZBH－1208were arrested in G2／M phase.The expression of active Caspase－3in the tumor cell was generally up－regulated.ConclusionComparison with CPT－11and／or SN38，the novel compound ZBH－1208was more efficient and lowertoxicity in significant inhibit growth of the tumor cells.ZBH－1208play an important role in the apoptosis inducement of tumor cells by arresting the tumor cells cycle and would positive contribute to on further research in clinical treatment.

Irinotecan；Derivatives；Cell cycle arrest；Cell apoptosis

R965.3

A

趙靜（1989－），女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究。

2014－10－25）

1007－4287（2015）02－0181－06

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（20130102097JC）；吉林省衛(wèi)生廳研究項(xiàng)目（2012Z037）

＊通訊作者