王建業(yè),張?zhí)煊?，喬曉峰，李長(zhǎng)德

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

三種藥物對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡與基因表達(dá)的影響①

王建業(yè),張?zhí)煊ⅲ瑔虝苑?，李長(zhǎng)德

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡與基因表達(dá)影響,探討正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片治療作用機(jī)理。方法：采用隨機(jī)分組，①正常對(duì)照組：Wistar大鼠，清潔級(jí)，沒(méi)有造模12只，喂飼普通飼料，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；②類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型組( 以下簡(jiǎn)稱模型組)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理鹽水1mL/100g.d；③正清風(fēng)痛寧緩釋片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清風(fēng)痛寧緩釋片藥液120mg/100g·d,低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清風(fēng)痛寧緩釋片藥液30mg/100g·d；④白芍總苷膠囊組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液50mg/100g·d,低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液10mg/100g·d；⑤萬(wàn)通筋骨片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃萬(wàn)通筋骨片藥液60mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃萬(wàn)通筋骨片藥液8mg/100g·d，五組給藥48d。結(jié)果：正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組滑膜細(xì)胞凋亡的數(shù)量上明顯高于造模組，CIA大鼠滑膜細(xì)胞造模組高于正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組組，CIA大鼠滑膜細(xì)胞造模組高于正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組組。結(jié)論：正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞可以起到很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用。

正清風(fēng)痛寧緩釋片； CIA大鼠；細(xì)胞凋亡

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis RA)是一種病因未明慢性以炎性滑膜炎為主自身免疫性疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變主要發(fā)生在滑膜。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理變化是滑膜襯里細(xì)胞增生與間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及微血管新生和血管翳形成，致使關(guān)節(jié)中軟骨和骨組織破壞。膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis RA)發(fā)病機(jī)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)比較正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡與基因表達(dá)影響，探索從滑膜細(xì)胞凋亡去研究中藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis RA)機(jī)制。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變關(guān)節(jié)與正常關(guān)節(jié)對(duì)比，早晨僵硬明顯，下午減輕明顯，剛開(kāi)始活動(dòng)疼痛較重，活動(dòng)多時(shí)僵硬減輕或消失。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

①藥物：正清風(fēng)痛寧緩釋片(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010174)主要成分青藤堿 ，具有除濕祛風(fēng)，通絡(luò)活血，止痛消腫；白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20055058)主要成分白芍總甙；萬(wàn)通筋骨片(通化萬(wàn)通藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025183)主要成分川烏(制)、草烏(制)、馬錢子(制)等二十五味中藥[3～5]。

②試劑：膠原蛋白II型/Collagen Type II(南京奧多福尼生物科技有限公司，CAS 900734，批號(hào)200326)；弗氏不完全佐劑/Freund’s Adjuvant Complete(mpbio公司，批號(hào)08642862)；10%中性福爾馬林；EDTA 緩沖液(上海百賽生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)。

③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠，清潔級(jí)，60只，體重(100±20)g，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

④儀器設(shè)備：奧林巴斯(OLYMPUS)CH-2雙目顯微鏡(上海維翰光電科技有限公司)、TKY-TSH(1600mL)生物組織智能脫水機(jī)(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)、康龍KL型生物組織組織包埋機(jī)(湖北康龍電子科技有限責(zé)任公司)、JJQ-P2016A生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)、QIQIAN/啟前HH-600三用恒溫水箱(上海啟前電子科技有限公司)、整支消毒手動(dòng)單道可調(diào)式移液器(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[1，2]

1.2.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立： Wistar大鼠，清潔級(jí)，50只，體重(100±20)g，采用0.1M醋酸溶解膠原蛋白II型/Collagen Type II (2mg/mL,4℃,12h),Wistar大鼠尾根部皮下注射0.2mg膠原蛋白10d模型成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片給藥：采用隨機(jī)分組，①正常對(duì)照組：Wistar大鼠，清潔級(jí)，沒(méi)有造模12只，喂飼普通飼料，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；②類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型組( 以下簡(jiǎn)稱模型組)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；③正清風(fēng)痛寧緩釋片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清風(fēng)痛寧緩釋片藥液120mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清風(fēng)痛寧緩釋片藥液30mg/100g·d；④白芍總苷膠囊組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液50mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液10mg/100g·d；⑤萬(wàn)通筋骨片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃萬(wàn)通筋骨片藥液60mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃萬(wàn)通筋骨片藥液8mg/100g·d，五組給藥48d，五個(gè)處理Wistar大鼠斷頭處死，膝關(guān)節(jié)取滑膜組織,放入10%中性福爾馬林液中固定、康龍KL型生物組織組織包埋機(jī)石蠟包埋，JJQ-P2016A生物組織切片機(jī)切片，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)和基因表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用堿性磷酸酶標(biāo)記法，免疫組織化學(xué)檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片免疫組織化學(xué)檢測(cè)p53基因表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1。

表1 正清風(fēng)痛寧緩釋片等對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片組CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)，見(jiàn)表2。正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組滑膜細(xì)胞凋亡的數(shù)量上明顯高于造模組(P<0.05)。基因表達(dá)方面,造模組遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各組(P<0.05)。

表2 正清風(fēng)痛寧緩釋片等對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)±s)

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis RA)是以炎性滑膜炎病變?yōu)橹髟虿幻鞯淖陨砻庖咝约膊?，主要在關(guān)節(jié)滑膜襯里細(xì)胞增生與間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及微血管新生和血管翳形成，致使關(guān)節(jié)中軟骨和骨組織破壞。

本研究發(fā)現(xiàn)正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組滑膜細(xì)胞凋亡的數(shù)量上明顯高于造模組。CIA大鼠滑膜細(xì)胞造模組高于正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組組。CIA大鼠滑膜細(xì)胞造模組高于正清風(fēng)痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬(wàn)通筋骨片高、低劑量組組。

正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片通過(guò)研究可以明顯抑制滑膜細(xì)胞增殖和滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)?？梢悦黠@誘導(dǎo)更多的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，影響調(diào)控因素很多，正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑要從相關(guān)蛋白和基因表達(dá)去探索。

通過(guò)正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡與基因表達(dá)研究，實(shí)驗(yàn)證明正清風(fēng)痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬(wàn)通筋骨片對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞可以起到很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，為青藤堿和白芍總甙在臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

[1]代淑華，江清林，辛華，等. 茶黃素和腦血通口服液治療大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(10)：1198-1200

[2]黃展，李春豐，王晶，等. 白頭翁正丁醇提取物對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37(2)：57-58

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黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：2012-215。

王建業(yè)(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

張?zhí)煊?1971～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任藥師。E-mail:zty-000@163.com。

Q344+.13

A

1008-0104(2015)01-0076-02

2014-11-12)