李俊超，胡 堅，楊春雷，胡國元，余 君，楊錦鵬

(1.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北武漢 430030;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北武漢 430070; 3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430074)

箬竹葉提取物對煙草病原真菌的抑制作用

李俊超1，2，胡 堅3，楊春雷1，胡國元3，余 君1，楊錦鵬1

(1.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北武漢 430030;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北武漢 430070; 3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430074)

采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法，對選用無水乙醇、冰乙酸和蒸餾水混合溶劑浸提所得的箬竹葉粗提物以及依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行液-液萃取所得的萃取物進行了抑菌活性測試。結(jié)果表明:箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長均具有抑制活性，其對兩種真菌抑制的EC50值分別為3.98 mg·mL-1和0.88 mg ·mL-1、EC90值分別為7.33mg·mL-1和1.73mg·mL-1;對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制的EC50值和EC90值分別為4.68 mg·mL-1和9.09 mg·mL-1。2 mg·mL-1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃余水相對煙草鏈格孢菌菌絲生長的抑制率分別為31.27%、36.18%、6.06%和-7.05%;對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率分別為56.82%、81.53%、12.32%和-18.10%。乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的抑制活性明顯高于箬竹葉粗提物，其對兩種真菌抑制的EC50值分別為2.99 mg·mL-1和0.80 mg·mL-1、EC90值分別為5.41 mg·mL-1和2.83 mg·mL-1。乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制的EC50值和EC90值分別為1.03 mg·mL-1和3.54 mg·mL-1。

箬竹;煙草鏈格孢菌;煙草疫霉菌;抑菌活性

近年來對箬竹(Indocalamus tessellatus)葉提取物抑菌作用的研究報道較多［1-4］。張慧等［1］以箬竹葉水提物和丙酮提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等7種菌進行了抑菌活性研究，結(jié)果表明，箬竹葉提取物對細(xì)菌具有一定的抑制作用。楊衛(wèi)東等［4］研究表明，箬竹葉的乙酸乙酯提取物對釀酒酵母菌和白色假絲酵母菌等5種供試菌表現(xiàn)出較強的抑制作用。但是，目前關(guān)于箬竹葉提取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌抑制作用的報道較少。作者以箬竹葉為原料，采用無水乙醇、冰乙酸和蒸餾水為混合溶劑進行恒溫浸提，然后以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對粗提物依次進行液-液萃取，測定了箬竹葉粗提物和萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌的抑制作用。

1 實驗

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

箬竹葉由湖北省煙草科學(xué)研究院提供，經(jīng)60℃烘干，粉碎過40目篩(孔徑0.45 mm)后，貯存于棕色玻璃瓶，置于干燥器中備用。

煙草鏈格孢菌(Alternaria alternate)和煙草疫霉菌(Phytophthora parasitica)，均由湖北省煙草科學(xué)研究院提供，實驗室保藏。

無水乙醇、石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇、蔗糖、七水硫酸亞鐵、四水氯化錳、七水硫酸鋅，均為分析純;瓊脂(040010)，Japan。

馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基［5］，用于煙草鏈格孢菌的活化與培養(yǎng);燕麥瓊脂(OA)培養(yǎng)基［5］，用于煙草疫霉菌的活化與培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 箬竹葉的浸提

稱取30 g預(yù)處理后的箬竹葉粉置于500 mL錐形瓶中，按料液比3∶5∶3∶12(g∶mL∶mL∶mL)的比例加入無水乙醇、冰乙酸和蒸餾水，即溶劑體系共計200 mL，密封后置于40℃恒溫?fù)u床150 r·min-1振蕩浸提2 d，抽濾，將濾液于60℃負(fù)壓真空濃縮至浸膏狀;濾渣再重復(fù)浸提一次。兩次所得浸膏合并，用無水乙醇溶解并抽濾，濾液濃縮至浸膏狀，稱重后用無水乙醇溶解粗提物，定容至400 mg·mL-1，即得到箬竹葉粗提液，于4℃冰箱冷藏備用［6］。

1.2.2 箬竹葉粗提物的萃取

取箬竹葉粗提液，濃縮成浸膏，加4倍體積的蒸餾水超聲溶解，調(diào)pH值至6.5［7］。依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，前3次萃取劑用量為水溶液的1/2，后續(xù)減半至1/4萃?。?］，以萃取劑不改變顏色為萃取終點［9］。各相萃取液和萃余水相在60℃下真空濃縮至浸膏狀，稱重后分別用無水乙醇定容至400 mg·mL-1，密封，于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 真菌活性檢測方法

1.2.3.1 菌絲生長速率法

向與待測菌相對應(yīng)的培養(yǎng)基內(nèi)加入備用的400 mg·mL-1的藥液，制成一定質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基平板，每組設(shè)3個重復(fù)，對照組則加入相同體積的分析純無水乙醇。用直徑7.68 mm打孔器切取在供試菌平板上(28±1)℃培養(yǎng)7 d的菌碟，用接種針挑取菌餅輕放于含藥培養(yǎng)基中央(每皿1塊，菌絲面朝下)，于(28±1)℃恒溫培養(yǎng)144 h后，觀測菌絲生長。用十字交叉法測量菌落直徑，按式(1)計算菌絲生長抑制率［6］，比較抑制效果。

1.2.3.2 載玻片孢子萌發(fā)法

將煙草鏈格孢菌接種到PSA平板上(28±1)℃培養(yǎng)14 d，用無菌水洗下分生孢子，4層紗布過濾除去菌絲體及破碎培養(yǎng)基，振蕩均勻。借助低倍顯微鏡用無菌蒸餾水對孢子懸浮液進行稀釋，將目鏡(10×10)視野內(nèi)的煙草鏈格孢菌孢子數(shù)控制在100個［5］。用體積分?jǐn)?shù)為2%的吐溫80水溶液將制備好的藥劑配成5個不同濃度的藥液，對照組則加入相同體積的分析純無水乙醇，在90℃水浴條件下將溶劑徹底揮發(fā)［10］后，與等量的孢子懸浮液混勻，分別滴在凹玻片上，每個樣品設(shè)3個平行，并用體積分?jǐn)?shù)為2%的吐溫80水溶液作對照。(28±1)℃培養(yǎng)6 h后(培養(yǎng)終點時對照組孢子萌發(fā)率理論上應(yīng)達(dá)到80%以上［11］)，每個處理重復(fù)隨機觀察3個以上視野，分別記錄孢子萌發(fā)數(shù)(孢子芽管長度大于孢子的短半徑視為萌發(fā))與不萌發(fā)數(shù)。按式(2)、(3)計算萌發(fā)率及孢子萌發(fā)抑制率［12］，比較抑制效果。

1.2.3.3 對病原真菌菌絲生長或孢子萌發(fā)的毒力測定

按照倍比稀釋法的原則，在一定范圍內(nèi)設(shè)置5組藥劑濃度梯度值，并采用菌絲生長速率法或載玻片孢子萌發(fā)法測定每組對應(yīng)的抑菌活性。利用濃度梯度值(x)和菌絲生長抑制率或孢子萌發(fā)抑制率的幾率值(y)，用OFFICE 2012軟件擬合直線毒力回歸方程，并求出對應(yīng)供試菌抑制率達(dá)到50%和90%時所對應(yīng)箬竹葉粗提物或萃取物的濃度值EC50值和EC90值［6］，以評價箬竹葉粗提物和萃取物對不同煙草病原真菌菌絲生長或孢子萌發(fā)的毒力大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的毒力(圖1)

由圖1可知，箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌的菌絲生長抑制活性隨著加藥濃度的增大而增強;相同濃度的箬竹葉粗提物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制作用明顯強于煙草鏈格孢菌;8 mg·mL-1的箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌菌絲生長的抑制率高達(dá)99.90%，其毒力回歸方程為y=11.921x+2.5879，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951，計算得出EC50值為3.98 mg· mL-1、EC90值為7.33 mg·mL-1;2 mg·mL-1的箬竹葉粗提物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率高達(dá)99.93%，其毒力回歸方程為y=47.054x+8.4629，相關(guān)系數(shù)R2=0.9908，計算得出 EC50值為0.88 mg· mL-1、EC90值為1.73 mg·mL-1。

2.2 箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的毒力(表1)

由表1可知:箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制活性隨加藥濃度的增大而增強;然而，要達(dá)到同等的抑制率，抑制孢子萌發(fā)實驗所需箬竹葉粗提物的加藥濃度要高于抑制菌絲生長實驗;10 mg· mL-1的箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到96.86%，其毒力回歸方程為y=9.0820x+ 7.4671，相關(guān)系數(shù) R2=0.9970;計算得出 EC50值為4.68 mg·mL-1、EC90值為9.09 mg·mL-1。

2.3 萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的抑制活性(圖2)

圖1 箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌(a)和煙草疫霉菌(b)菌絲生長的毒力Fig.1 Antifungal toxicity of primary components from Indocalamus tessellatus leaves tom ycelium grow th rate of A.alternate(a)and P.parasitica(b)

菌落直徑/mm供試菌株濃度mg·mL-1加藥組 對照組菌絲生長抑制率/%煙草鏈格孢菌8 7.71±0.28 45.73±0.89 99.90 4 34.83±0.28 58.52±1.20 46.60 2 49.22±1.54 62.86±1.98 24.72 1 56.54±1.01 65.93±2.65 16.13 0.5 60.94±0.81 67.10±1.63 10.36煙草疫霉菌2 7.72±0.36 61.54±1.49 99.93 1 30.46±0.14 65.36±1.42 60.51 0.5 46.84±3.13 66.77±0.34 33.73 0.25 56.91±0.48 68.22±0.58 18.68 0.125 62.46±1.49 69.09±0.87 10.80

表1 箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的毒力Tab.1 Antifungal toxicity of primary com ponents from Indocalamus tessellatus leaves to spore germ ination of A.alternate

圖2 萃取物對煙草鏈格孢菌(a)和煙草疫霉菌(b)菌絲生長的抑制活性Fig.2 The inhibitory activity of extraction components to m ycelium grow th rate of A.alternate(a)and P.parasitica(b)

注:萃取物濃度為2 mg·mL-1。

由圖2可知，3種有機相萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，但萃余水相卻都表現(xiàn)出一定的促進作用。在2 mg ·mL-1時，4種萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率大小順序依次為:乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞萃余水相。

2.4 乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的毒力(圖3)

圖3 乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌(a)和煙草疫霉菌(b)菌絲生長的毒力Fig.3 Antifungal toxicity of ethyl acetate phase component tom ycelium grow th rate of A.alternate(a)and P.parasitica(b)

供試菌株 濃度mg·mL菌落直徑/mm-1加藥組 對照組菌絲生長抑制率/%煙草鏈格孢菌4 17.14±0.25 37.47±0.66 68.25 2 37.22±1.45 50.03±1.94 30.25 1 65.19±1.31 76.73±0.67 16.72 0.5 75.99±0.84 75.50±1.13 11.95 0.25 76.48±0.84 78.46±1.13 4.21煙草疫霉菌4 7.71±0.17 55.65±2.12 99.93 2 18.36±0.25 65.52±2.12 81.53 1 40.27±1.43 78.35±1.02 53.89 0.5 52.33±2.26 79.08±0.82 37.46 0.25 75.99±0.84 79.42±1.03 11.95

由圖3可知，乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌的菌絲生長抑制活性隨著加藥濃度的增大而增強;相同濃度的乙酸乙酯萃取物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制作用明顯高于煙草鏈格孢菌;4 mg· mL-1的乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌菌絲生長的抑制率高達(dá)68.25%，其毒力回歸方程為y=16.517x +0.6746，相關(guān)系數(shù)R2=0.9907，計算得出EC50值為2.99 mg·mL-1、EC90值為5.41 mg·mL-1;4 mg· mL-1的乙酸乙酯萃取物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率高達(dá)99.93%，其毒力回歸方程為y=21.196x+ 24.060，相關(guān)系數(shù) R2=0.9947，計算得出 EC50值為0.80 mg·mL-1、EC90值為2.83 mg·mL-1。

2.5 乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的毒力(表2)

由表2可知:乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制活性隨著加藥濃度的增大而增強;然而，要達(dá)到同等的抑制率，孢子萌發(fā)實驗所需乙酸乙酯萃取物的加藥濃度要高于菌絲生長實驗;5mg·mL-1的乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)98.12%，其毒力回歸方程為y=17.066x+23.135，相關(guān)系數(shù)R2=0.9938，計算得出EC50值為1.03 mg· mL-1、EC90值為3.54 mg·mL-1。

表2 乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)的毒力Tab.2 Antifungal toxicity of ethyl acetate phase component to spore germ ination of A.alternate

2.6 討論

1)箬竹葉粗提物對兩種煙草病原真菌菌絲具有較強的抑制活性，且隨著濃度的增大抑制率逐漸上升;對比發(fā)現(xiàn)其對煙草疫霉菌的防效優(yōu)于煙草鏈格孢菌，為植物源農(nóng)藥在煙草病害的防治工作方面奠定了一定的基礎(chǔ)。此外，箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)也表現(xiàn)出較強的抑制活性，與張志英等［13］的研究結(jié)果相似。

2)箬竹葉粗提物中對兩種煙草病原真菌起到抑制效果最高的萃取組分均出現(xiàn)在乙酸乙酯相的萃取液中，與黃亞利［3］的研究結(jié)果相似。

3)乙酸乙酯萃取物抑制煙草鏈格孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50值和EC90值均明顯低于對應(yīng)箬竹葉粗提物。表明箬竹葉抑菌活性成分通過萃取工藝，達(dá)到了預(yù)期的提純效果。

3 結(jié)論

采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法，對選用無水乙醇、冰乙酸和蒸餾水混合溶劑浸提所得的箬竹葉粗提物以及依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行液-液萃取所得的萃取物進行了抑菌活性測試。結(jié)果表明:箬竹葉粗提物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長均具有抑制活性，其對兩種真菌抑制的EC50值分別為3.98 mg·mL-1和0.88 mg·mL-1、EC90值分別為7.33 mg·mL-1和1.73 mg·mL-1;對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制的EC50值和EC90值分別為4.68 mg· mL-1和9.09 mg·mL-1。2 mg·mL-1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃余水相對煙草鏈格孢菌菌絲生長的抑制率分別為31.27%、36.18%、6.06%和-7.05%;對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制率分別為56.82%、81.53%、12.32%和-18.10%。乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長的抑制活性明顯高于箬竹葉粗提物，其對兩種真菌抑制的EC50值分別為2.99 mg·mL-1和0.80 mg·mL-1、EC90值分別為5.41 mg·mL-1和2.83 mg·mL-1。乙酸乙酯萃取物對煙草鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制的 EC50值和EC90值分別為1.03 mg·mL-1和3.54 mg·mL-1。

［1］ 張慧，林海萍，盛恩浩，等.箬竹提取物抑菌活性研究［J］.浙江林業(yè)科技，2010，30(3):38-41.

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Inhibitory Activity of Indocalamus Tessellatus Leaves Against Pathogenic Fungi of Tobacco

LI Jun-chao1，2，HU Jian3，YANG Chun-lei1，HU Guo-yuan3，YU Jun1，YANG Jin-peng1
(1.Tobacco Research Institute of Hubei Province，Wuhan 430030，China; 2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China; 3.School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China)

After being dipped by ethanol，acetic acid and distilled water and then extracted with petroleum ether，ethyl acetate and n-butyl alcohol in sequence，the antifungal ingredients of Indocalamus tessellatus leaves were isolated. The antifungal activity was investigated bymeans ofmycelium growth rate and spore germination.Results indicated that primary components of Indocalamus tessellatus leaves exhibited inhibitory activity to both fungus，the value of EC50and EC90of primary components tomycelium growth rate of A.alternate were 3.98 mg·mL-1and 7.33 mg·mL-1;and to mycelium growth rate of P.parasitica were 0.88 mg·mL-1and 1.73 mg·mL-1;and to spore germination of A.alternate were 4.68 mg·mL-1and 9.09 mg·mL-1.The inhibitory rate of extraction phase of petroleum ether，ethyl acetate，n-butyl alcohol and raffinatewater phasewith the concentration of2mg·mL-1tomycelium growth rate of A.alternate were 31.27%，36.18%，6.06%and-7.05%;and to mycelium growth rate of P.parasitica were 56.82%，81.53%，12.32%and-18.10%.The inhibitory activity of ethyl acetate extraction phase against pathogenic fungi of tobacco was obviously higher than primary components of Indocalamus tessellatus leaves.The value of EC50and EC90of ethyl acetate extraction phase tomycelium growth rate of A.alternate were 2.99mg·mL-1and 5.41mg·mL-1;and to mycelium growth rate of P.parasitica were 0.80 mg·mL-1and 2.83 mg·mL-1;and to spore germination of A.alternate were 1.03 mg·mL-1and 3.54 mg·mL-1.

Indocalamus tessellatus;Alternaria alternate;Phytophthora parasitory;antifungal activity

Q 949.2

A

1672-5425(2015)02-0043-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.011

國家科技重點項目(中煙辦［2013］212號)

2014-10-27

李俊超(1990-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向:植物源農(nóng)藥，E-mail:lijunchao0124@webmail.hzau.edu.cn;通訊作者:楊春雷，研究員，E-mail:ycl193737@163.com;胡國元，博士，教授，E-mail:hgy701@163.com。