涂業(yè)桃，張筱惠，鄧 劍

（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

丙型肝炎患者血清自身抗體檢測的相關(guān)分析

涂業(yè)桃1，張筱惠2，鄧 劍2

（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

目的 了解慢性丙型肝炎患者血清中自身抗體陽性率，探討自身免疫在丙型肝炎病毒（HCV）感染中的意義。方法 選取2014年1月至2015年3月該院收治的丙型肝炎患者127例作為丙型肝炎組，另選取同期該院體檢中心健康體檢者30例作為對照組。采用間接免疫熒光法（IIF）檢測兩組受檢者血清中抗核抗體（ANA），免疫印跡法檢測抗線粒體抗體（AMA）、抗可提取性核抗原（ENA）抗體、抗肝抗原抗體譜，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測血清 HCVRNA含量。結(jié)果 丙型肝炎組有61例檢測出1項(xiàng)或1項(xiàng)以上自身抗體陽性，自身抗體陽性率為48.03%（61/127），高于對照組的3.33%（1/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。丙型肝炎組HCV-RNA陽性46例，其中自身抗體陽性29例（63.04%），HCV-RNA陰性81例，自身抗體陽性32例（39.51%），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 HCV感染機(jī)體可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種自身抗體，尤其以HCV-RNA陽性患者更為明顯，HCV感染者有必要進(jìn)行血清自身抗體檢測，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生對患者實(shí)施個體化治療。

肝炎，丙型； 肝炎病毒/免疫學(xué)； RNA，病毒； 肝炎，自身免疫性； 自身抗體

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的全世界流行的傳染病，其主要傳播方式為輸血等血液接觸傳播。HCV感染后患者無明顯的臨床癥狀，容易被忽視，但其在體內(nèi)長期存在可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌，因此也越來越受到臨床的重視[1]。近年來，隨著對HCV研究的深入，人們認(rèn)識到HCV感染者血清中?？梢詸z測出自身抗體，自身抗體可導(dǎo)致多種組織器官功能的紊亂，加重丙型肝炎患者的病毒血癥[2-3]。本研究通過對127例丙型肝炎患者血清中自身抗體的檢測，分析HCV患者與血清中自身抗體的相關(guān)性，有助于了解患者自身免疫狀態(tài)并指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年3月本院門診收治和住院的丙型肝炎患者127例作為丙型肝炎組，其中男69例，女58例；年齡16～81歲，平均（54.56± 13.42）歲。臨床診斷符合2004年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。根據(jù)HCV-RNA陰性和陽性，將127例HCV患者分成HCV-RNA陰性組（81例）和HCV-RNA陽性組（46例）。另選取本院體檢中心健康體檢者30例作為對照組，其中男18例，女12例；年齡18～75歲，平均（43.78± 10.63）歲。所有對照組受檢者均排除病毒感染、自身免疫性疾病及其他引起免疫功能改變的疾病。所有患者在近3個月內(nèi)均未使用免疫制劑。

1.2 方法

1.2.1 血清中抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）、抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）檢測ANA、AMA檢測采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）。ANA檢測基質(zhì)選用HEP-2細(xì)胞和猴肝組織的冰凍切片作為靶抗原；AMA檢測基質(zhì)選用鼠腎組織的冰凍切片作為靶抗原。待檢測血清1∶100稀釋，將稀釋的待測血清與生物載片（反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定有包被基質(zhì)的生物薄片）共同溫育30 min，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗體（熒光二抗）第2次溫育30 min，洗片，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。組織或細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特征性綠色熒光，滴度大于或等于1∶100時為陽性。間接免疫熒光樣本前處理儀IF Sprinter及所有試劑購自德國歐蒙公司。所有步驟嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.2 抗可提取性核抗原（anti-extractable nuclear antigen，ENA）檢測 應(yīng)用免疫印跡法檢測ENA（包括15種靶抗原：nRNP/Sm、Sm、SSA、Ro-52、SSB、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、Nucleosomes、Histones、Rib.P-Prot、AMA-M2）抗體、抗肝抗原抗體譜[包括AMA-M2、抗可溶性肝抗原抗體（抗SLA抗體）、抗肝/腎微粒體1型抗體（抗LKM-1抗體）和抗肝細(xì)胞胞質(zhì)抗原1型抗體（抗LC-1抗體）4種抗體]。將包被有各種抗原的檢測膜條放置于溫育槽內(nèi)，膜條上有編號的一面朝上。在溫育槽中分別加入1.5 mL樣本緩沖液，振蕩孵育5min后，吸去溫育槽中的液體。再加入1.5 mL 1∶100的已稀釋血清樣本，室溫振蕩孵育30 min。吸去液體，用1.5 mL緩沖液清洗膜條3次，每次5 min。加入1.5 mL已稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG，再振蕩孵育30 min。清洗3次，每次5min。加入1.5mL底物液，溫育10min。蒸餾水洗3次，每次1 min。風(fēng)干后判定膜條上結(jié)果。全自動蛋白印跡儀EURO Blotmaster購自德國歐蒙公司，試劑由歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷公司提供。所有步驟嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.3 HCV-RNA檢測 采用HCV核酸定量檢測試劑盒（深圳凱杰生物工程有限公司）及實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)（real time PCR system，美國ABI7500 Fast基因擴(kuò)增儀）檢測HCV RNA。

1.2.4 HCV抗體檢測 采用ELISA法進(jìn)行HCV抗體檢測，試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。所有步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受檢者自身抗體陽性情況 丙型肝炎組中，有61例患者檢測出1項(xiàng)或1項(xiàng)以上自身抗體陽性，檢出率為48.03%（61/127）；對照組中有1例檢測出自身抗體陽性，檢出率為3.33%（1/30），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組受檢者自身抗體陽性情況[n（%）]

2.2 丙型肝炎患者HCV-RNA與自身抗體的關(guān)系 HCVRNA陽性組患者中自身抗體檢出率為63.04%（29/46），HCV-RNA陰性組中自身抗體檢出率為39.51%（32/81）；兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

丙型肝炎是全世界流行的傳染病，由HCV感染所致，其在我國的感染率僅次于乙型肝炎病毒（HBV）。HCV感染后患者起初無明顯臨床癥狀，極易慢性化，繼而演變?yōu)楦斡不透渭?xì)胞性肝癌，嚴(yán)重威脅著人類的健康[5]。

HCV感染存在自身免疫現(xiàn)象，慢性丙型肝炎患者血清中常可以檢出多種自身抗體。有研究表明，自身免疫性疾病的啟動因子是病毒感染，靶細(xì)胞的抗原成分改變或病毒蛋白與正常組織細(xì)胞的同源性可誘發(fā)自身免疫，并認(rèn)為HCV感染可通過分子模擬現(xiàn)象激活自身免疫反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，從而導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)[6]。而自身免疫是機(jī)體對自身組織成分免疫應(yīng)答過于亢進(jìn)的表現(xiàn)，可能為丙型肝炎患者肝功能損害的主要因素之一。目前臨床上對于慢性丙型肝炎的治療主要采用干擾素聯(lián)合利巴韋林，此方案對低效價自身抗體的丙型肝炎患者有較好療效，但由于干擾素治療可能會誘發(fā)患者出現(xiàn)自身免疫性疾病，特別是對于高滴度自身抗體的丙型肝炎患者[7-8]。因此，丙型肝炎患者進(jìn)行自身抗體檢測及病毒載量分析，有助于了解患者自身免疫狀態(tài)及指導(dǎo)臨床選擇治療方案。

本研究結(jié)果顯示，48.03%（61/127）的患者至少檢測出一項(xiàng)自身抗體陽性，其中以ANA的陽性率最高（41.73%），其次為抗ENA抗體（29.92%），然后為AMA（6.30%）和抗肝抗原抗體譜（3.94%）。以上4種自身抗體的陽性率及總陽性率均明顯高于對照組，提示HCV感染可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，使患者出現(xiàn)多種自身抗體，這往往提示體內(nèi)免疫功能已出現(xiàn)紊亂，同時也可能提示有利于病毒復(fù)制。本文HCV-RNA陽性組中自身抗體檢出率為63.04%，HCV-RNA陰性組中自身抗體檢出率為39.51%。HCVRNA陽性的丙型肝炎患者其自身抗體的陽性率高于單純抗HCV陽性丙型肝炎患者，自身抗體的出現(xiàn)與HCV復(fù)制活躍呈密切正相關(guān)，與王蓉等[9]報道一致。這在一定程度上說明HCV-RNA陽性的丙型肝炎患者發(fā)生自身免疫反應(yīng)更為嚴(yán)重[10]。

ANA對于很多自身免疫性疾病有診斷價值。在不同疾病中，特別是風(fēng)濕性疾病，其抗體譜有一定的特異性，檢測ENA對于不同類型風(fēng)濕?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、干燥綜合征等）意義重大。在許多自身免疫性疾病中檢測到AMA具有診斷價值，尤其是對診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）有著特殊意義。PBC是一種原因不明的慢性炎癥性肝臟疾病，被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，檢測AMA中的AMA-M2是PBC的一個靈敏而特異的診斷指標(biāo)。而抗肝抗原抗體譜中SLA、LKM-1、LC-1抗體被認(rèn)為是自身免疫性肝炎的主要標(biāo)志性抗體。

已有研究結(jié)果證實(shí)，誘發(fā)自身免疫是HCV致病的一個重要機(jī)制，約1/3的HCV感染者血清中可檢測到針對肝細(xì)胞成分自身抗體[11]，如AMA-M2、SLA、LKM-1等，它們可加重肝細(xì)胞損傷，誘發(fā)自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原發(fā)性膽汁性肝硬化等自身免疫性疾病。大多數(shù)情況下，丙型肝炎與AIH較容易鑒別，但是當(dāng)病毒感染和自身免疫現(xiàn)象共存時，由于激發(fā)丙型肝炎自身免疫反應(yīng)的抗原較弱，鑒別常比較困難。鑒于AIH與丙型肝炎的關(guān)系密切，且治療原則截然不同（臨床上對于AIH的治療首選皮質(zhì)類固醇激素或其他免疫抑制劑，而丙型肝炎則采用利巴韋林聯(lián)合干擾素），正確區(qū)分合并HCV感染的自身免疫性肝炎和伴自身免疫現(xiàn)象的丙型肝炎顯得尤為重要[2]。自身抗體的檢測有助于AIH和丙型肝炎的鑒別診斷，AIH患者所產(chǎn)生的自身抗體中，最常見、發(fā)現(xiàn)最早的自身抗體是ANA。鄧紀(jì)望等[12]指出，AIH患者血清中ANA的陽性率高于丙型肝炎患者，且AIH患者ANA以高滴度為主，丙型肝炎患者則以低滴度抗體為主。因此，檢測患者ANA陽性率及滴度，對AIH和丙型肝炎的鑒別診斷和制訂有效的治療方案具有重要意義。

綜上所述，HCV感染機(jī)體后可通過多種途徑損害免疫系統(tǒng)，破壞機(jī)體的免疫耐受性，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。同時，HCV復(fù)制可促進(jìn)自身免疫異常，進(jìn)一步加重肝臟損害，使病情遷延不愈。而關(guān)于HCV感染者合并自身免疫現(xiàn)象，以及自身免疫性疾病是否與血清中存在的自身抗體相關(guān)，存在自身抗體的HCV感染者并發(fā)自身免疫性疾病的概率及對疾病的嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸有何影響，目前尚無定論，還有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證，因此，臨床醫(yī)生應(yīng)高度重視合并自身免疫性肝病的HCV感染者的個體化治療。

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Analysis on correlation of serum autoantibodies detections in patients with hepatitis C

Tu Yetao1，Zhang Xiaohui2，Deng Jian2
（1.Department of Blood Transfusion；2.Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To understand the positive rate of serum autoantibodies in the patients with chronic hepatitis C and to investigate the significance of autoimmune in hepatitis C virus（HCV）infection.Methods 127 hepatitis C patients treated in our hospital from January 2014 to March 2015 were selected as the hepatitis C group and 30 persons undergoing the healthy phys icalexamination were selected as the controlgroup.The indirectimmunofluorescence（IIF）method was adopted to detect antinuclear antibody（ANA），the immunoblotting method was adopted to detect anti-mitochondrial antibody（AMA），anti-extractable nuclear antigen（ENA）and anti-liver antigen antibody spectrum，The serum HCV-RNA content was detected by using by fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）.Results 61 cases in the hepatitis C group were detected in one item or more of au toantibodies positive，the autoantibody positive rate was 48.03%（61/127），which was higher than 3.33%（1/30）in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；in the hepatitis C group，46 cases were HCV-RNA positive，in which 29 cases（63.04%）were autoantibody positive，81 cases were HCV-RNA negative，32 cases（39.51%）were autoantibody positive，the differences between the 2 groups were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion HCV infection in the body can induce the autoimmune reaction and produce a variety of autoantibodies，which is more significant especially in the patients with HCVRNA positive.It is necessary for the HCV infected person to test the serum autoantibodies，thus guide the clinical doctors to implement the individualized treatment for the patients.

Hepatitis C； Hepatitis viruses/immunology； RNA，viral； Hepatitis，autoimmune； Autoantibodies

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.007

A

1009-5519（2015）23-3546-03

2015-08-09）

涂業(yè)桃（1971-），男，四川瀘州人，主管技師，主要從事臨床輸血與免疫學(xué)檢驗(yàn)工作；E-mail：511383487@qq.com。