尹鵬飛，常家聰

骨橋蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

尹鵬飛，常家聰

摘要目的探討骨橋蛋白（OPN）在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化SP法測定112例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁正常組織中OPN表達(dá)水平，分析OPN表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果結(jié)直腸癌組織中OPN陽性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其表達(dá)水平與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、原發(fā)腫瘤浸潤深度相關(guān)；OPN陽性表達(dá)組的無病生存時間和總體生存時間均短于陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。OPN的陽性表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立影響因素。結(jié)論結(jié)直腸癌患者癌組織中OPN呈高表達(dá)，OPN在組織中的高表達(dá)與患者的早期復(fù)發(fā)及不良預(yù)后密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞結(jié)直腸癌；骨橋蛋白；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

結(jié)直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率已升至所有惡性腫瘤的第3位［1］，死亡率也不斷增高。結(jié)直腸癌患者早期缺乏特異性的表現(xiàn)，很多患者確診時已屬中晚期，5年生存率不足40%。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移成為影響預(yù)后的主要因素之一，惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移包括基質(zhì)的降解、細(xì)胞遷移、血管生成等很多變化，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種與腫瘤有關(guān)的蛋白質(zhì)，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。該實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌組織中OPN的表達(dá)，探討其與結(jié)直腸癌患者各臨床病理特征之間的關(guān)系以及對預(yù)后的影響。

1　材料與方法

1．1病例資料

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科2008年3月～2009年4月經(jīng)手術(shù)治療的112例結(jié)直腸癌患者的癌組織及距離癌組織邊緣5 cm以上相應(yīng)的正常癌旁組織標(biāo)本，癌組織均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。所有患者術(shù)前未接受化療、放療等其他治療。手術(shù)后電話或者門診隨訪，并記錄隨訪資料，所有納入患者的末次隨訪時間截至2014年5 月1日。

2015－05－14接收

1．2主要試劑

濃縮型鼠抗人OPN單克隆抗體購于北京博奧森公司；通用型免疫組化試劑盒、PBS緩沖液、DAB顯色劑等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1．3方法

采用免疫組化SP法檢測結(jié)直腸癌組織中OPN的表達(dá)，所有標(biāo)本經(jīng)過石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。操作步驟按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性結(jié)直腸癌組織切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1．4免疫組化結(jié)果判定

根據(jù)組織切片著色范圍和強(qiáng)度表示結(jié)果，在高倍鏡下，每張切片選擇5個具有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個癌細(xì)胞，一共計數(shù)500個細(xì)胞。采用半定量計分法判定：OPN主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按陽性著色程度評分：0分為無著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。按陽性細(xì)胞占比例評分：0分為＜5%、1分為5%～10%、2分為11%～50%、3分為 51% ～80%、4分為＞80%，兩者乘積判斷陽性結(jié)果：0分為陰性（－）；1～4分為弱陽性（＋）；5～8分為中度陽性（＋＋）；9～12分為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。將（＋＋）～（＋＋＋）定義為OPN蛋白陽性表達(dá)組，（－）～（＋）定義為OPN蛋白陰性表達(dá)組。

1．5統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析，針對結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中OPN表達(dá)陽性率的比較以及OPN表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系采用X2檢驗。生存分析使用Kaplan-Meier曲線法，兩組間差異采用Log-rank檢驗。應(yīng)用COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析以確定影響結(jié)直腸癌患者生存率的獨立預(yù)后因素；所有檢驗為雙側(cè)概率檢驗。

2　結(jié)果

2.1OPN在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

OPN在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中有不同程度的陽性表達(dá)，結(jié)直腸癌組織中OPN陽性表達(dá)65例，陽性表達(dá)率為58．0%（65／112）；癌旁正常組織OPN陽性表達(dá)11例，陽性表達(dá)率為9．80%（11／112）。結(jié)直腸癌組織中OPN陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2＝58．07，P＜0．05）。見圖1。

2.2結(jié)直腸癌織中OPN表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者的組織中OPN陽性表達(dá)率與腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤的分化程度、原發(fā)腫瘤浸潤深度相關(guān)（P＜0．05），而與性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

表1　OPN陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3OPN蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的分析

截至2014年5月隨訪結(jié)束時，112例結(jié)直腸癌患者獲得完整的隨訪資料，隨訪時間為4～69個月，中位隨訪時間為38個月；隨訪期間72例患者死亡，5年累積生存率為36．1%。應(yīng)用Kaplan-Meier方法分析OPN蛋白在組織中的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，OPN蛋白陽性表達(dá)組的結(jié)直腸癌患者的中位生存期為18．6個月，OPN蛋白陰性表達(dá)組的患者中位生存期為47．9個月。OPN陰性表達(dá)組患者的生存時間明顯高于OPN陽性表達(dá)組，Log-rank檢驗提示，兩組患者的無病生存期和總體生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Logrank＝12．666、13．250，P＜0．001），表明OPN蛋白陽性表達(dá)組的結(jié)直腸癌患者無病生存期和總體生存期明顯比OPN蛋白陰性表達(dá)組的結(jié)直腸癌患者的無病生存期和總體生存期短。見圖2。

2．4結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時間的多因素回歸分析

將性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM分期、腫瘤分化程度和OPN表達(dá)（陰性表達(dá)和陽性表達(dá)）等因素引入COX模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，OPN表達(dá)陽性與原發(fā)腫瘤直徑是影響結(jié)直腸癌患者無病生存期的獨立影響因素（P＜0．05）。其中OPN表達(dá)和原發(fā)腫瘤直徑的回歸系數(shù)均為正，表明OPN表達(dá)陽性和腫瘤直徑大于5 cm的結(jié)直腸癌患者術(shù)后無病生存時間短；同時，OPN表達(dá)陽性、TNM分期和原發(fā)腫瘤直徑是影響結(jié)直腸癌患者總體生存期的獨立影響因素，其中OPN表達(dá)、TNM分期和原發(fā)腫瘤直徑的回歸系數(shù)均為正，表明OPN表達(dá)陽性、TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期和腫瘤直徑大于5 cm的結(jié)直腸癌患者術(shù)后總體生存時間短。見表2。

表2　無病生存率和總體生存率的單因素及多因素COX比例風(fēng)險回歸分析

3　討論

OPN是由Senger et al［2］從惡性轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞株中提取出來的，研究［3］表明，OPN在人類惡性腫瘤組織中過度表達(dá)，與腫瘤分期密切相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但確切的致癌機(jī)制尚不明確，可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移［4］以及通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［5］、促進(jìn)腫瘤血管形成［6］等多種途徑促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究［7］顯示抑制OPN的表達(dá)能夠減緩腫瘤的生長及侵犯進(jìn)程。研究［8］表明，OPN的過度表達(dá)與乳腺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤的惡性程度侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。

本研究顯示結(jié)直腸癌組織中OPN陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，提示高表達(dá)的OPN可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究探討了OPN的表達(dá)與結(jié)直腸癌生物學(xué)特性之間的關(guān)系，結(jié)直腸癌組織OPN的表達(dá)水平在TNM分期Ⅲ／Ⅳ期明顯高于Ⅰ／Ⅱ期，這表明OPN的水平隨著結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展而表達(dá)逐漸增強(qiáng)；因此可以對組織進(jìn)行檢測OPN水平來判斷和評估結(jié)直腸癌的侵襲程度、轉(zhuǎn)移情況，與研究［9］結(jié)果相似。OPN的表達(dá)還與結(jié)直腸癌的原發(fā)腫瘤直徑明顯相關(guān)，提示OPN不僅參與了腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移，也可能參與了腫瘤的發(fā)生。研究［10］顯示OPN不僅能通過與整合素受體結(jié)合而且能與CD44家族受體相結(jié)合，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的趨化、黏附、轉(zhuǎn)移；由上表明高表達(dá)的OPN可能成為判斷結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移程度的一個指標(biāo)，研究［11］顯示，缺失OPN的模型小鼠形成肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)明顯減少，因此研究新型的以O(shè)PN為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療可能為結(jié)直腸癌的治療提供新的分子靶向途徑。

本研究的創(chuàng)新之處在于通過對112例有完整隨訪資料的結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時間進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OPN陽性表達(dá)組的無病生存時間和總體生存時間均短于OPN陰性表達(dá)組。應(yīng)用COX比例風(fēng)險模型多因素生存分析，顯示OPN陽性表達(dá)是結(jié)直腸癌患者術(shù)后無病生存率和總體生存率的獨立影響因素，有可能成為判斷和評估結(jié)直腸患者預(yù)后的一種新的生物學(xué)指標(biāo)。

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中圖分類號R 735．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1493－04

基金項目：安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研資助項目（編號：09A034）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥230022

作者簡介：尹鵬飛，男，碩士研究生；常家聰，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：changjiacong13＠aliyun．com

Expression of osteopontin in colorectal cancer with clinical pathological characteristics and prognosis

Yin Pengfei，Chang Jiacong
（Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the relationship between the osteopontin（OPN）expression of colorectal cancer tissueswith the clinical characteristics and prognosis．MethodsThe expressions of OPN in colorectal cancer tissues and their corresponding para-cancerous tissues from 112 cases of colorectal cancer patientswere detccted by immunohistochemistry．The relationship between the expressions ofOPN and the clinicopathological features in paitientswith colorectal cancer were analyzed．ResultsThe OPN expression of colorectal cancer tissues was significantly higher than their corresponding adjacent normal tissues，the difference was statistically significant（P＜0．05）．Its expression was significantly associated with tumor size，histological differentiation，TNM stage，tumor status．Disease-free survival，and overall survival time of OPN protein positive expression group were lower than thatof the negative group，respectively，the differenceswere statistically significant（P＜0．05）．The expression of OPN in colorectal cancer tissueswas an independent prognostic factor．ConclusionThe expression of OPN is significantly increased in colorectal cancer tissues，and the positive expression of OPN is associated with the prognostic of patientswith colorectal cancer．

Key wordscolorectal cancer；osteopontin；immunohistochemistry；prognostic