劉卉娟等

摘要：采用PDA-苯胺藍(lán)顯示法檢測了20株木腐菌的產(chǎn)漆酶特性，初篩選出8株產(chǎn)漆酶菌株，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)一步檢測其漆酶活性。結(jié)果顯示，能夠產(chǎn)生漆酶的菌株中只有6株檢測到漆酶活性，其中SWFC9938產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)，最高平均酶活性可達(dá)1 656.82 U/mL，為高產(chǎn)漆酶菌株。Cu2+和藜蘆醇誘導(dǎo)能顯著提高SWFC9938的產(chǎn)酶能力，最高平均酶活性分別可達(dá)2 485.10和2 454.24 U/mL。藜蘆醇能明顯縮短最高產(chǎn)酶的發(fā)酵時間，發(fā)酵8 d時即出現(xiàn)酶活性高峰（對照出現(xiàn)在12 d以后），藜蘆醇對SWFC9938菌株具有很好的誘導(dǎo)產(chǎn)酶活性。

關(guān)鍵詞：木腐菌；漆酶；菌株篩選；誘導(dǎo)培養(yǎng)

中圖分類號：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2858-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.012

The Screening on the High Production of Laccase from 20 Wood-rotting Fungi

LIU Hui-Juan，AO Xin-yu，HONG Hai-di，YANG Yan-xian，CHEN Yu-hui

（College Of Life Science， Southwest Forestry University， Kunming 650224， Yunnan，China）

Abstract： Used PDA-aniline blue display method to detect the 20 strains producing laccase properties of wood rotting fungi，selected 8 strains producing laccase strains and developed further testing the laccase activity by liquid fermentation. The results showed that，the crude laccase which liquid fermentation among six potential strains exhibited high catalytic activity and the highest laccase activity approximated 1 656.82 U/mL for SWFC 9938. It was found that copper and veratryl alcohol were the best laccase inducers for strain SWFC 9938 with 2 485.10 U/mL and 2 454.24 U/mL respectively. Veratryl alcohol could obviously shorten the fermentation time of the maximum enzyme production，the maximum laccase activity appeared at 8 days cultivation （the maximum laccase activity of control material was at 12 days cultivation）， indicating that veratryl alcohol might be laccase-induced potential.

Key words： wood rotting fungi；laccase；strains screening；induction training

木質(zhì)素是一種以苯丙烷為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的芳香族高分子化合物，為植物主要組成成分之一。木質(zhì)素在植物組織中與半纖維素以共價鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋其中，形成一種堅(jiān)固的天然屏障，使一般微生物及其酶很難侵染和進(jìn)入，從而導(dǎo)致木質(zhì)素的降解成為地球生物圈中碳素循環(huán)的主要障礙[1]。自然界參與降解木質(zhì)素的微生物有真菌、放線菌和細(xì)菌等，但已知的惟一能廣泛降解木質(zhì)素的生物是真菌[2]。因此從真菌中篩選高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的菌株對實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的降解具有重要意義。木質(zhì)素降解需要木質(zhì)素降解酶，木質(zhì)素降解酶有3種，即木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）、錳依賴性過氧化物酶（Mnp）和漆酶（Laccase）[3]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶（EC1.10.3.2），廣泛存在于真菌中。由于漆酶作用底物廣泛，包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾體激素和生物色素、金屬有機(jī)化合物等。因此被廣泛應(yīng)用于木質(zhì)素降解、生物制漿與漂白、染料脫色、含酚廢水檢測及處理、生物傳感等方面[4]。漆酶降解木質(zhì)素流程簡單，不需要H2O2和其他次級代謝產(chǎn)物的參與，克服了H2O2極易分解的難題，具有更大的實(shí)際應(yīng)用價值[5]，因此受到廣泛關(guān)注。

本研究對采自云南、廣西、江西、浙江等地的20株隸屬于12個屬的木腐菌進(jìn)行篩選，旨在了解其產(chǎn)酶特性并從中獲得高產(chǎn)漆酶菌株，為其開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

20株供試菌株由西南林業(yè)大學(xué)提供，菌株的種類及來源分別為：裂褶菌（Schizophyllum commune），編號SWFC9967，采自云南西雙版納。齒貝栓菌（Trametes cervina），編號SWFC10288，采自云南大理。彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），編號SWFC8557；毛栓菌（Trametes hirsuta），編號SWFC8755；褐蝶（Polystictus pterygodes），編號SWFC9215，采自云南思茅。白囊孔菌（Hirschioporus lacteus），編號SWFC8298；煙色血革菌（Haematostereum gausapatum），編號SWFC8345；粗毛韌革菌（Stereum hirsutum），編號SWFC8751，采自云南昆明。厚血革菌（Haematostereum australe），編號SWFC11058；紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola），編號SWFC11177；裂褶菌（Schizophyllum commune），編號SWFC11392a；軟線囊孔菌（Hirschioporus vellereus），編號SWFC11396；裂擬迷孔菌（Daedaleopsis confragosa），編號SWFC11431；木蹄層孔菌（Fomes fomentarius），編號SWFC11453；褐蓋韌革菌（Stereum vibrans），編號SWFC11696；薄刷革菌（Stereum radiatofissum），編號SWFC11667，采自云南麗江。彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），編號SWFC9938，采自廣西南寧。黑殼針層孔菌（Phellinus rhabarinus），編號SWFC10046，采自廣西上思。血紅密孔菌（Pycnoporus sanguieues），編號SWFC11044，采自江西玉山。絨毛栓菌（Tramets pubescens），編號SWFC11160，采自浙江杭州。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基 選擇PDA培養(yǎng)基用作活化培養(yǎng)基。

1.2.2 篩選培養(yǎng)基 在PDA培養(yǎng)基中按0.1 g/L的比例加入苯胺藍(lán)，制備成PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基[6]，用作篩選培養(yǎng)基。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 采用PD培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別加入20 mg/L CuSO4·5H2O和2 mmol/L藜蘆醇構(gòu)成Cu2+誘導(dǎo)培養(yǎng)基和藜蘆醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試菌株的活化培養(yǎng) 從存放于4 ℃冰箱的試管中挑出供試菌株，接種于PDA培養(yǎng)基上，在（28±2） ℃條件下培養(yǎng)至菌落長滿培養(yǎng)皿備用。

1.3.2 產(chǎn)漆酶菌株初篩 采用PDA-苯胺藍(lán)顯色試驗(yàn)進(jìn)行菌株產(chǎn)漆酶初篩[7]。用12 mm無菌打孔器切取PDA平板上培養(yǎng)好的菌落，接種至PDA-苯胺藍(lán)平板上并置于（28±2） ℃條件下培養(yǎng)10 d，每天定時觀察記錄菌落周圍有無變色現(xiàn)象產(chǎn)生，有記為“+”，無記為“-”。最后根據(jù)所產(chǎn)棕色氧化圈的大小，初步篩選出產(chǎn)漆酶的菌株。每一菌株設(shè)3個重復(fù)。

1.4 產(chǎn)漆酶菌株的復(fù)篩

1.4.1 粗酶液的制備 將初篩獲得的產(chǎn)漆酶菌株采用PDA平板培養(yǎng)， 待長滿平板后，用12 mm的無菌打孔器切取培養(yǎng)皿外圈的菌落，分別接入PD和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種3個菌片， 于（28±2） ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 d并從第4天開始每間隔2 d取樣1次。培養(yǎng)液經(jīng)8層紗布過濾，4 ℃、 6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液[8]。

1.4.2 漆酶活性測定 采用 ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]法測定粗酶液中漆酶的活性[9]。在含0.5 mmol/L ABTS的0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.0） 2 mL中，加入1 mL酶液后啟動反應(yīng)，在420 nm波長下測定反應(yīng)的前3 min內(nèi)反應(yīng)液的吸光度變化。以1 mL酶液加0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.0）2 mL做空白對照。以每分鐘使 1 μmol/L ABTS被轉(zhuǎn)化所需的酶量為1個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

20株木腐菌在PDA-苯胺藍(lán)顯色平板上培養(yǎng)時培養(yǎng)基的顏色變化的結(jié)果如表1所示。由表1可知，20個供試菌株中，有12個菌株在整個培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基顏色始終保持不變，表明這些菌株在漆酶初篩培養(yǎng)基（PDA-苯胺藍(lán)）上生長時不能產(chǎn)生漆酶。另有8個菌株在漆酶初篩培養(yǎng)基上生長至第2天時菌落周圍的培養(yǎng)基的顏色便開始出現(xiàn)了變化，并隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的棕色氧化圈且氧化圈逐漸增大，表明這些菌株在漆酶初篩培養(yǎng)基上生長時能夠產(chǎn)生漆酶，為產(chǎn)漆酶菌株。8個產(chǎn)漆酶菌株分別為SWFC8557、SWFC8755、SWFC 9938、SWFC10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWF

C11396和SWFC11431。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 8株產(chǎn)漆酶菌株在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時產(chǎn)漆酶的能力 對初篩獲得的8株產(chǎn)漆酶木腐菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，采用液體發(fā)酵的方法進(jìn)行篩選，結(jié)果如表2所示。由表2可知，8株供試菌株在基本培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)條件下，不同菌株產(chǎn)漆酶能力存在很大差異。8株菌株中有2株菌株（SWFC11160和SWFC11431）在整個培養(yǎng)過程中發(fā)酵液僅檢測到微弱的漆酶活性，而其他6株菌在培養(yǎng)過程中檢測到較強(qiáng)的漆酶活性，但不同菌株所產(chǎn)漆酶活性的大小和出現(xiàn)酶活性高峰的時間存在明顯差異。6株菌株中在不同培養(yǎng)時間內(nèi)產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)的菌株為SWFC 9938，其最大平均酶活性超過1 600 U/mL（12 d和14 d），其次為SWFC8557和SWFC11392a菌株，其最大平均酶活性分別達(dá)到935.99（16 d）和694.59 U/mL（14 d）。而菌株SWFC8755和SWFC11396產(chǎn)漆酶能力則相對較差，其最高平均酶活性僅分別達(dá)到48.33和63.78 U/mL，但產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)較早，均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第6天，隨后酶活性則逐漸下降，其中以SWFC11396菌株尤為明顯。

2.2.2 誘導(dǎo)劑（Cu2+誘和藜蘆醇）對8株木腐菌產(chǎn)漆酶的影響 采用Cu2+誘導(dǎo)培養(yǎng)基和藜蘆醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基對初篩獲得的8株產(chǎn)漆酶木腐菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定發(fā)酵液中漆酶活性以考察誘導(dǎo)劑Cu2+和藜蘆醇對供試菌株產(chǎn)漆酶的影響，結(jié)果如表3和表4所示。由表3和表4可知，兩種誘導(dǎo)劑對不同菌株產(chǎn)漆酶的影響不同。Cu2+和藜蘆醇不能對在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（對照）中幾乎不產(chǎn)漆酶的菌株SWFC 11160和SWFC11431產(chǎn)生影響，即兩種誘導(dǎo)劑均不能誘導(dǎo)其產(chǎn)生漆酶，但卻能對在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)漆酶的菌株的產(chǎn)酶能力造成不同程度的影響。Cu2+對產(chǎn)酶較弱的SWFC11396菌株的產(chǎn)漆酶能力影響不大，并在一定程度上抑制了SWFC8755菌株的產(chǎn)酶能力，而藜蘆醇則可提高SWFC8755菌株的產(chǎn)酶能力，但卻抑制SWFC11396的產(chǎn)酶能力。

兩種誘導(dǎo)劑對產(chǎn)漆酶能力相對較好的3株菌株（SWFC11392a、SWFC8557和 SWFC10288）產(chǎn)酶的影響主要表現(xiàn)為可縮短酶活高峰出現(xiàn)的時間，一般可縮短4～6 d，同時兩種誘導(dǎo)劑對酶活性的影響則表現(xiàn)出Cu2+的誘導(dǎo)活性高于藜蘆醇的誘導(dǎo)活性（圖1，圖2和圖3）。在6株液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶菌株中，受兩種誘導(dǎo)劑影響最大的是產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)的SWFC9938菌株，兩種誘導(dǎo)劑均能提高其產(chǎn)漆酶能力（圖4）。在培養(yǎng)的前12 d內(nèi)，Cu2+對其產(chǎn)漆酶的影響不大，漆酶活性與對照相比差異較小，但當(dāng)培養(yǎng)時間超過12 d后，漆酶活性迅速升高，最高平均酶活達(dá)到2 485.10 U/mL（16 d），較對照最高平均酶活（1 656.82 U/mL）提高了50%；而藜蘆醇則在整個培養(yǎng)過程中漆酶活性均高于對照且酶活高峰前移，在培養(yǎng)的前8 d酶活性升高迅速，第8天時達(dá)到酶活高峰（對照酶活高峰出現(xiàn)在第12天），漆酶活性達(dá)到2 454.24 U/mL，較對照第8天時的平均酶活（849.47 U/mL）提高了189%。

3 小結(jié)與討論

對20株木腐菌首先采用PDA-苯胺藍(lán)篩選平板進(jìn)行初篩，結(jié)果顯示有8個菌株能夠產(chǎn)生漆酶，分別為SWFC8557、SWFC8755、SWFC9938、SWFC 10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWFC11396和

SWFC11431。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)時，無論有無誘導(dǎo)劑存在均只在6株菌的發(fā)酵液中檢測到漆酶活性，其中漆酶活性最高的為SWFC9938，為高產(chǎn)漆酶菌株；其次為SWFC8557和SWFC11392a。6株產(chǎn)漆酶菌株的產(chǎn)酶能力大小為：SWFC9938>SWFC11392a、SWFC8557>SWFC10288>SWFC11396、SWFC8755>SWFC11431、SWFC11160。

Cu2+和藜蘆醇是常用的木質(zhì)素降解酶誘導(dǎo)劑，研究結(jié)果顯示，兩種誘導(dǎo)劑對產(chǎn)漆酶菌株的產(chǎn)酶誘導(dǎo)活性存在一定差異。相比而言，Cu2+的誘導(dǎo)活性普遍高于藜蘆醇的誘導(dǎo)活性，而藜蘆醇誘導(dǎo)幾乎都能使產(chǎn)酶高峰提前，不同菌株的最適誘導(dǎo)劑存在差異。

本研究篩選獲得的SWFC9938菌株的產(chǎn)漆酶能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他菌株，且在兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶能力明顯提高，其中以藜蘆醇的誘導(dǎo)作用最好，培養(yǎng)8 d時產(chǎn)酶量便可達(dá)到最大，酶活性達(dá)到2 454.24 U/mL。藜蘆醇可明顯縮短SWFC9938產(chǎn)酶發(fā)酵時間，是一種較為理想的誘導(dǎo)劑。

同種不同來源的木腐菌在人工培養(yǎng)條件下產(chǎn)漆酶能力存在很大差異。SWFC8557和SWFC9938同為彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），而SWFC9967和SWFC11392a則同為裂褶菌（Schizophyllum commune），但其來源地不同，產(chǎn)漆酶的能力也明顯不同。SWFC9938在人工培養(yǎng)條件下的產(chǎn)漆酶能力遠(yuǎn)高于SWFC8557，而SWFC11392a在人工培養(yǎng)條件下具有產(chǎn)漆酶能力，但SWFC9967則無產(chǎn)漆酶能力。所以對不同來源的同種木腐菌進(jìn)行篩選是非常必要的，而究竟是什么原因?qū)е鲁霈F(xiàn)產(chǎn)酶能力的差異值得進(jìn)一步深入研究。

本研究中的高產(chǎn)漆酶菌株SWFC9938為彩絨革蓋菌，屬于白腐菌的一種。白腐菌具有特殊的代謝類型及獨(dú)有的細(xì)胞外降解特性，能降解各種生物難降解的有機(jī)污染物而成為近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[10]。由于白腐菌是漆酶的主要產(chǎn)生菌，因此從自然界白腐菌中篩選新的高性能產(chǎn)酶菌株是解決漆酶資源短缺的一條重要途徑[11-13]。然而真正在自然生長條件下具有很高漆酶活性產(chǎn)量的菌株并不多，能夠篩選到優(yōu)良自然突變體的機(jī)會也更小[14]，這就增加了菌種篩選的難度。郭梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)彩絨革蓋菌是產(chǎn)漆酶的菌株。Youn等[16]在研究白腐菌產(chǎn)漆酶在木質(zhì)素降解中的作用時，也證實(shí)彩絨革蓋菌是漆酶的高產(chǎn)菌。由于菌種不同來源的差異，各個菌株之間營養(yǎng)條件和生長條件有所不同，產(chǎn)生漆酶的能力也不同，有關(guān)SWFC9938菌株在人工培養(yǎng)下的最佳產(chǎn)酶條件尚有待進(jìn)一步研究。

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