汪華華，謝安娜，王湘利，張召，劉海洋（華南理工大學(xué)化學(xué)系，廣州 510640）

鎵卟啉配合物的光動(dòng)力抗腫瘤活性研究

汪華華，謝安娜，王湘利，張召，劉海洋?
（華南理工大學(xué)化學(xué)系，廣州 510640）

以5,10,15,20-四（乙氧基羰基）卟啉和GaCl3為原料合成了5,10,15,20-四（乙氧基羰基）卟啉鎵（GaTECP）配合物，并對(duì)其進(jìn)行了紫外可見(jiàn)光譜，高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜表征。利用M TT法研究了GaTECP對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、子宮頸癌細(xì)胞H ela和人肝癌細(xì)胞H ep G2的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)其在暗條件下幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，但在光照條件下顯示較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。此外，還進(jìn)一步研究了GaTECP在A549細(xì)胞內(nèi)的定位及其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，并測(cè)定了活性氧物種和線粒體膜電位的變化。結(jié)果顯示被細(xì)胞吸收的GaTECP主要定位在A549的線粒體上，光輻照后能產(chǎn)生活性氧物種和降低線粒體的膜電位，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

卟啉；鎵；抗腫瘤活性；細(xì)胞毒性；光動(dòng)力治療

引言

光動(dòng)力療法（PDT）是目前腫瘤治療中比較被人們所認(rèn)可的一種手段。與傳統(tǒng)的抗癌治療相比較，PDT有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，如治療位置和治療時(shí)間的控制以及重復(fù)使用藥物劑量的可能性［1］。在PDT中，三個(gè)無(wú)毒成分（光敏劑，光和分子氧）僅在腫瘤組織中聯(lián)合產(chǎn)生活性氧物種（ROS），尤其是單線態(tài)氧。因此，光動(dòng)力療法與傳統(tǒng)的癌癥治療方法有很大的不同，如放療、手術(shù)或化療，可以提高患者的生活質(zhì)量。然而，光動(dòng)力療法是目前腫瘤治療由于光敏劑的低效率而受到限制，因此需要開(kāi)發(fā)新型高效的光敏劑。為了增加光敏劑效果，以下的藥理作用和光化學(xué)效率有待提高［2］：1）根據(jù)腫瘤的吸收效率，細(xì)胞攝取效率和從正常組織中清除效率等提高腫瘤的選擇性積累效率；2）從紅光到近紅外區(qū)域強(qiáng)的光吸收效率；3）單線態(tài)氧等活性氧物種的量子產(chǎn)率要高。

卟啉及其金屬配合物是穩(wěn)定的天然功能性染料，其具有大的可見(jiàn)光消光系數(shù)、剛性結(jié)構(gòu)和有效的光化學(xué)電子轉(zhuǎn)移能力，已被廣泛的用于各種光捕獲和光電器件材料研究［3］。卟啉及其金屬配合物作為光動(dòng)力治療中的光敏劑分子，能夠有效的把光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能，傳遞能量給分子氧從而生成具有高活性的單線態(tài)氧［4］。此外卟啉類化合物易于在腫瘤部位富集，這是抗腫瘤藥物非常重要的特性［5-7］。

我們最近報(bào)道了中位乙氧基羰基取代的卟啉相對(duì)于其他芳基取代的卟啉具有更好的平面結(jié)構(gòu)［8］。目前對(duì)該類金屬卟林啉配合物基礎(chǔ)性質(zhì)研究并不多。本文合成了這一卟林家族一個(gè)新的鎵配合物5，10，15，20-四（乙氧基羰基）卟啉鎵（GaTECP），研究了它對(duì)多株人腫瘤細(xì)胞的光毒性。結(jié)果表明該配合物對(duì)A549癌細(xì)胞有很好的光動(dòng)力治療效果，是一種潛在的抗腫瘤藥物。在光照條件下，GaTECP能夠提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的生成，減低線粒體的膜電位，通過(guò)氧化損傷誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

日本島津Shimadzu UV-2450 （PC）型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；日本HITACHI F-4500熒光光譜儀；德國(guó)布魯克Avance III 400 MHz核磁共振儀；德國(guó)卡爾蔡司Axio Observer Z1熒光顯微鏡；美國(guó)伯騰ELx808吸收光酶標(biāo)儀。96孔培養(yǎng)板（海門市博陽(yáng)實(shí)驗(yàn)器材廠）；TDL-50B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； pH計(jì)（PB-10）；10L-lS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市華美實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；YX280B高壓滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；Advantage A10 Milli-Q純水儀（MILLIPORE 公司）；YT-CJ-IND 型潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；AL104-6020電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；HFI 60w水套式二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）。

MTT（美國(guó)Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選A549人肺腺癌細(xì)胞、Hela子宮頸癌細(xì)胞、Hep G2人肝癌細(xì)胞，均由ATCC（American Type Culture Collection）公司提供；Tissue Culture Dishes培養(yǎng)皿（Greiner bio-one公司）；胎牛血清（上海雅吉生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Amresco公司）；0.25% Trypsin-0.01% EDTA（自己配制）；二甲基亞砜（Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（自己配制）；滅菌生理鹽水（自己配制）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 鎵卟啉的合成

5，10，15，20-四（乙氧基羰基）卟啉（TECP按參考文獻(xiàn)方法合成［8］。

在100mL的圓底燒瓶中加入60mg的TECP和20倍當(dāng)量的GaCl3（352mg），然后加入20mL吡啶作為溶劑，攪拌回流6h，用紫外監(jiān)測(cè)直到反應(yīng)完全，冷卻至室溫。將反應(yīng)液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去吡啶溶劑，得到粗產(chǎn)品。用100-200目硅膠柱分離純化，以二氯甲烷和甲醇（VDCM∶VMeOH=97∶3）的混合溶液作為淋洗劑，最終得到紫色的固體。產(chǎn)率70%。Uv-Vis （DMSO） λmax（ε， ［103 M-1-cm-1］）: 413 （283.45）546 （13.80） 583 （4.53）；HR-MS C32H28GaN4O8［M-Cl］+實(shí)際值：665.115 5，理論值：665.115 7；1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 9.64 （s， 8H）， 5.04 （s， 8H）， 1.79 （s， 12H）。

1.3 MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

測(cè)試指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2～3次，然后用1mL胰酶消化為懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度到1.5×104個(gè)/ mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加200μL，細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。在37℃、5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24h，細(xì)胞貼壁后，吸去上清液，加入新的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入GaTECP，每孔總體積200μL。繼續(xù)培養(yǎng)2h后，距離培養(yǎng)皿15.5cm處用625nm波長(zhǎng)的燈光照1h，繼續(xù)培養(yǎng)21h。然后每孔加入20μL的MTT（5mg/mL），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上層清液每孔加入100μL 的DMSO，振蕩使甲攢結(jié)晶完全溶解后，測(cè)定波長(zhǎng)在570nm下各孔的吸光度值。在無(wú)光照條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為暗對(duì)照。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)活力：

細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490×100%

根據(jù)所測(cè)得的各細(xì)胞存活率，計(jì)算軟件計(jì)算目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.4 細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)

生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞與GaTECP在37℃、5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育12h。然后細(xì)胞用PBS洗滌三次，加入1mL細(xì)胞固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）于室溫下固定細(xì)胞，20min后用PBS緩沖液洗滌，在黑暗環(huán)境進(jìn)行Hoechst 33342 （5μg/mL）和R123（5μM）染色30min，棄去染色液，PBS緩沖液洗滌2～3次后，熒光顯微鏡拍照。

1.5 細(xì)胞核形態(tài)變化

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞與GaTECP首先在37°C、5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h，距離培養(yǎng)皿15.5cm處用625nm波長(zhǎng)的燈光照1h，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)21h后待測(cè)。將待測(cè)細(xì)胞取出用PBS緩沖液洗滌三次，加入1mL細(xì)胞固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）于室溫下固定細(xì)胞，20min后用PBS緩沖液洗滌，在黑暗環(huán)境進(jìn)行Hoechst 33342 （5μg/mL）染色3～5min，棄去染色液，PBS緩沖液洗滌2～3次后，熒光顯微鏡拍照，觀察目標(biāo)化合物處理腫瘤細(xì)胞核的狀態(tài)變化。分別在無(wú)光照、光照不加藥和暗光加藥條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照組。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種到6孔板中，在37°C、5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24h。待細(xì)胞貼壁后，吸去上清液，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入化合物GaTECP，每孔總體積為200μL。將藥物處理過(guò)的A549細(xì)胞放入上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，距離培養(yǎng)皿15.5cm處用625nm波長(zhǎng)的燈光照射1h，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)21h待測(cè)。將待測(cè)細(xì)胞取出至于黑暗環(huán)境中，每孔加入H2DCF-DA （10mM）染色20min，用PBS-EDTA緩沖液洗滌兩次，用熒光顯微鏡拍照。分別在無(wú)光照、光照不加藥和暗光加藥條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照組。

1.7 線粒體膜電位的測(cè)定

將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種到6孔板中，在37°C、5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24h。細(xì)胞貼壁后，吸去上清液，加入新的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入化合物GaTECP，每孔總體積200μL。將6孔板放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，距離培養(yǎng)皿15.5cm處用625nm波長(zhǎng)的燈光照1h，放入上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)21h后待測(cè)。然后在黑暗中每孔加入JC-1染液（1mL）染色20min后，用JC-1緩沖液洗滌兩次，用熒光顯微鏡拍照。分別在無(wú)光照、光照不加藥和暗光加藥條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 GaTECP的抗腫瘤活性

表1 GaTECP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株增殖抑制的影響

表1列出了GaTECP對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。在暗條件下它的細(xì)胞毒性很小，但是在紅光光照的條件下對(duì)三種腫瘤細(xì)胞都具有很好的細(xì)胞毒性。尤其是對(duì)A549細(xì)胞的半抑制濃度能夠降低到3.2μM，說(shuō)明GaTECP是一種潛在的光動(dòng)力治療藥物。

圖1 GaTECP在A549細(xì)胞內(nèi)定位。（a：細(xì)胞核染色；

圖2 GaTECP對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.2 GaTECP在A549細(xì)胞內(nèi)定位

化合物與乳腺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)24h后加細(xì)胞固定液，經(jīng)Hoechst 33342和R123染色，在熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞核為藍(lán)色，線粒體為綠色。如圖1中a和b所示。

從圖中可以看出，GaTECP能夠進(jìn)入細(xì)胞，并且在細(xì)胞內(nèi)顯示紅色熒光，紅色熒光的區(qū)域與細(xì)胞中線粒體染色后的綠色熒光區(qū)域相吻合。由此可以說(shuō)明GaTECP能夠進(jìn)入細(xì)胞并且定位在線粒體中。

2.3 GaTECP對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3 GaTECP對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的變化。

抗腫瘤藥物與癌細(xì)胞作用后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞形態(tài)由舒展的柳葉狀通過(guò)皺縮現(xiàn)象，最終變成圓形顆粒態(tài)。我們分別通過(guò)暗對(duì)照、光照對(duì)照、暗光不加藥對(duì)照和光照加藥實(shí)驗(yàn)來(lái)考察GaTECP在光照條件下對(duì)A549細(xì)胞的形態(tài)影響。在明場(chǎng)下觀察細(xì)胞形態(tài)（見(jiàn)圖2），三個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的形態(tài)并沒(méi)有很明顯的變化，但是GaTECP在光照條件下很明顯的觀察到了細(xì)胞的皺縮現(xiàn)象。由此可以說(shuō)明GaTECP對(duì)A549細(xì)胞具有良好的光毒性，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。通過(guò)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行Hoechst 33342的染色，從熒光顯微鏡下同樣也可以看到前三個(gè)對(duì)照組的細(xì)胞核形態(tài)沒(méi)有太大的變化，而藥物在光照下的實(shí)驗(yàn)看到圖中的細(xì)胞核數(shù)目明顯變少，并且呈圓珠狀聚集在一起（見(jiàn)圖3）。

2.4 GaTECP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的影響

光動(dòng)力治療中其中很重要的一方面是光敏劑在受光照激發(fā)后產(chǎn)生單線態(tài)氧、羥基自由基和超氧陰離子自由基等活性氧物種。該物種可以通過(guò)染料H2DCF-DA染色顯示綠色熒光［9］。從圖4中可以看出在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有觀察到活性氧物種的產(chǎn)生，而GaTECP在光照條件下可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察到明顯的綠色熒光，說(shuō)明光照射后細(xì)胞內(nèi)有活性氧物種的產(chǎn)生?；钚匝跷锓N對(duì)細(xì)胞器的氧化損傷是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。在明場(chǎng)顯微照片中也可以明顯看到GaTECP在光照下能促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡。

2.5 GaTECP對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

線粒體是細(xì)胞外源性和內(nèi)源性凋亡途徑研究的一個(gè)重要細(xì)胞器［10，11］。從上面GaTECP的細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)可知GaTECP定位在線粒體上，而影響線粒體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過(guò)程中其中很重要的一個(gè)特征是線粒體膜電位的降低。膜電位的變化一般通過(guò)JC-1染料的染色，觀察其熒光的變化。圖5是膜電位變化的熒光顯示圖?？梢钥闯觯齻€(gè)對(duì)照組都顯示紅色熒光，說(shuō)明線粒體膜電位正常，經(jīng)過(guò)GaTECP孵育和光照處理的腫瘤細(xì)胞中，線粒體很明顯看到有綠色熒光的產(chǎn)生。

圖4 GaTECP在光照后產(chǎn)生活性氧物種。（A：暗對(duì)照；B：光照不加藥對(duì)照；C：暗光加藥對(duì)照；D：光照加藥）

3 結(jié)束語(yǔ)

本文合成了GaTECP，并研究了其對(duì)三株腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。發(fā)現(xiàn)它對(duì)所試腫瘤細(xì)胞有較好的光毒性。GaTECP尤其對(duì)A549有很強(qiáng)的光毒性。它能被腫瘤細(xì)胞吸收，并主要分布在線粒體上。在光照條件下它能夠產(chǎn)生活性氧物種，降低線粒體的膜電位，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

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Study on the Photodynamic Antitumor Activity of Gallium Porphyrin Complex

WANG Hua-hua，XIE An-na, ZHANG Zhao, LIU Hai-yang?
（Department of Chemistry, South China University of Technology, GuangZhou 510640 ）

5,10,15,20-tetra(ethoxycarbonyl)porphyrin Gallium(III) chloride （GaTECP） was prepared by reaction of 5,10,15,20- tetra(ethoxycarbonyl)porphyrin and GaCl3, and characterized by UV-Vis, high resolution mass and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Cytotoxicity of GaTECP towards human lung adenocarcinoma A549, cervical carcinoma Hela and Hep G2 cells were investigated using MTT method. GaTECP exhibited little cytotoxicity. However, the cytotoxicity to the tested tumor cell lines were greatly enhanced under light irradiation. The effect of GaTECP to the cell morphology and its localization in the tumor cells was further checked by using A549 cell lines. The determination of reactive oxygen species and the change of mitochondrial membrane potential was performed too. The results showed that the cell uptake GaTECP was located in the mitochondria of A549 cell. Under irradiation, ,reactive oxygen species and the decrease in the membrane potential of mitochondria could be observed, which eventually leds to cells apoptosis.

Porphyrin; Gallium; Antitumor activity; Cytotoxicity; Photodynamic Therapy

O614

A

2096-0387（2015）01-0001-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（21171057， 21371059），華工中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（x2hgD2141030）資助項(xiàng)目

簡(jiǎn)介：劉海洋，教授，博士生導(dǎo)師。

汪華華（1987-），男，浙江衢州人，在讀博士，研究方向：無(wú)機(jī)化學(xué)。