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常用非甾體抗炎藥對成骨細(xì)胞增殖和骨形成蛋白的影響

2015-09-29 02:51陳堅(jiān)屠永剛李善文張佩
頸腰痛雜志 2015年6期
關(guān)鍵詞:非甾體抗炎藥含藥

陳堅(jiān),屠永剛,李善文,張佩

(1.東莞市常平醫(yī)院,廣東 523560;2.中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院,廣東 528421;3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,510515)

常用非甾體抗炎藥對成骨細(xì)胞增殖和骨形成蛋白的影響

陳堅(jiān)1,屠永剛1,李善文2,張佩3

(1.東莞市常平醫(yī)院,廣東523560;2.中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院,廣東528421;3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,510515)

目的觀察幾種臨床常用非甾體抗炎藥含藥血清對人成骨細(xì)胞增殖和骨形成蛋白表達(dá)的影響,為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法選取臨床常用的非甾體抗炎藥(阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸鈉、美洛昔康、尼美舒利、塞來昔布)及生理鹽水,按照人-動(dòng)物體表面積換算劑量,予大鼠連續(xù)灌胃5次,第5次結(jié)束后1h采集大鼠血液制備含藥血清。以強(qiáng)直性脊柱炎患者全髖置換術(shù)中股骨松質(zhì)骨分離得到的成骨細(xì)胞為研究對象,實(shí)驗(yàn)分為含藥血清組和空白血清組。采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色來鑒定細(xì)胞,采用CCK-8法檢測各組血清對人成骨細(xì)胞增殖的影響及酶聯(lián)免疫法檢測對骨形成蛋白2的表達(dá)。結(jié)果濃度為20%的含藥血清可能會抑制成骨細(xì)胞的增殖,10%的含藥血清相對來說細(xì)胞的效應(yīng)最穩(wěn)定;對細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2生成的影響方面,雙氯芬酸鈉組、美洛昔康片組、塞來昔布膠囊組較對照組平均值低,其中雙氯芬酸鈉組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 幾種非甾體抗炎藥對成骨細(xì)胞的增殖和骨形成蛋白表達(dá)的影響不一,其中雙氯芬酸鈉的抑制效果較明顯,其治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)制可能與影響了骨形成蛋白有關(guān)。

非甾體抗炎藥;成骨細(xì)胞;增殖;骨形成蛋白/骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一種病因尚未闡明以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱慢性炎癥為主的全身性疾病,其特征性病理表現(xiàn)為肌腱、韌帶附著點(diǎn)炎癥,常見癥狀為腰背部的僵硬或疼痛,休息無改善,活動(dòng)后可以緩解;晚期可發(fā)生脊柱強(qiáng)直、畸形以至嚴(yán)重的功能受損。其一線用藥包含非甾體類抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory drugs,NSAIDs),目前有研究發(fā)現(xiàn),長期服用此類藥物能抑制AS的新骨形成,延緩病情發(fā)展[1],但隨之也會帶來胃腸道、心血管等方面的不良反應(yīng)及治療的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。如何選擇非甾體類抗炎藥以達(dá)到長久、安全的防治效果,是目前亟需解決的難題。哪種藥物效果更佳,以及不同劑量效果是否存在差異,目前相關(guān)研究較少。為此,本實(shí)驗(yàn)擬通過血清藥理學(xué)的方法對比觀察幾種常見非甾體抗炎藥對成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響,為臨床選藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1常用的非甾體類抗炎藥A.阿司匹林腸溶片(拜阿司匹靈),B.布洛芬膠囊(芬必得),C.雙氯芬酸鈉(扶他林),D.美洛昔康片(莫比可),E.尼美舒利片(靈泰幫尼),F(xiàn).塞來昔布膠囊(西樂葆),均購于本院西藥房。

1.1.2主要試劑優(yōu)質(zhì)南美胎牛血清(Gibco);α-MEM培養(yǎng)基(Gibco);DMEM-F12、0.25%胰酶(Hyclone);Ⅱ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、地塞米松、茜素紅(Sigma);青-鏈霉素液、PBS(廣州天駿生物科技有限公司);堿性磷酸酶測試盒(南京建成科技有限有限公司);BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);人骨形成蛋白-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(廣州昂科生物技術(shù)有限公司)。1.1.3動(dòng)物SD(Sprague-Dawley)系清潔級雄性大鼠28只,體重250~300 g,普通飼養(yǎng)環(huán)境,分7組:A組、B組、C組、D組、E組、F組、對照組G(生理鹽水組),每組4只。大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號:SCXK(粵)2011-0015)。

1.2骨組織標(biāo)本來源從廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院及本院收集骨組織標(biāo)本(經(jīng)患者及我院倫理委員會同意,由主刀醫(yī)師手術(shù)取材),病例為強(qiáng)直性脊柱炎患者,按1984年的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷,患者手術(shù)前2個(gè)月未曾服用過抗骨質(zhì)疏松藥物、非甾體類抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素類及腫瘤壞死因子拮抗劑等影響骨代謝的藥物,現(xiàn)實(shí)施全髖置換術(shù),取出的股骨頭松質(zhì)骨立即進(jìn)入加有雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)液中備用。

1.3含藥血清的制備28只SD大鼠隨機(jī)分成7組,不同的藥物按照人-動(dòng)物體表換算給藥,每天分2次灌胃,1 mL/次,對照組予相同量的生理鹽水。第5次灌胃完1 h后,所有大鼠麻醉,腹主動(dòng)脈取血,血液4℃靜置2 h,3000 r/min離心15 min,吸取上清,各組混勻。所收集的血清于56℃滅活30 min,保存于-80℃,備用。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1人成骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)通過改良Pamela方法[3]:取出無菌松質(zhì)骨組織,用剪刀去除表面的軟組織,PBS沖洗3遍至骨質(zhì)發(fā)白。剪成1 mm× 1 mm×1 mm的骨塊,用PBS沖凈殘留的血跡,平鋪在培養(yǎng)皿中加入0.25%胰酶,37℃孵箱消化30 min。血清終止消化,去胰酶后加入0.1%Ⅱ型膠原酶,37℃孵箱消化3 h。取上層消化液離心留細(xì)胞加入20%完全培養(yǎng)液(20%小牛血清+DMEM-F12+雙抗)重懸細(xì)胞,接種于培養(yǎng)皿內(nèi);骨塊也同樣加入全培,置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d換液1次。骨塊約15 d后逐漸有細(xì)胞爬出。細(xì)胞匯合鋪滿80%后使用胰酶消化,1:3傳代培養(yǎng),換10%完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)采用第3~5代細(xì)胞。

1.4.2成骨細(xì)胞形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)生長狀態(tài),并在合適條件下加入骨誘導(dǎo)劑(10 mmol/mlβ-甘油磷酸鈉,50μmol/m l抗壞血酸磷酸鹽,0.1μmol/ml地塞米松)。

1.4.3成骨細(xì)胞的鑒定取2-3代生長良好的細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸,接種于6孔板中,3 d后按照堿性磷酸酯酶試劑盒說明進(jìn)行染色。另取細(xì)胞用含骨誘導(dǎo)劑的條件培養(yǎng)液培養(yǎng),21 d后,進(jìn)行茜素紅染色。染色后,蒸餾水沖洗,自然風(fēng)干。低倍鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1細(xì)胞增殖的檢測取2-3代生長良好的細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,鏡檢計(jì)數(shù)后,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸,接種于96孔板中,每孔100 μl。24 h細(xì)胞貼壁后,棄原培養(yǎng)液,換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,棄無血清培養(yǎng)液,依次分別加入不同濃度(5%、10%、20%)的各組含藥血清,每孔200μl,每個(gè)劑量均設(shè)10個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,按CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行操作,于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處,測定光密度殖(OD)。

1.5.2骨形成蛋白2(BMP-2)含量的測定取第3代生長良好的細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸,接種于6孔板中,每孔2 ml,24 h后更換為含10%各組血清培養(yǎng),于培養(yǎng)的第3天收集上清,按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件處理,組間比較應(yīng)用ONE-Way ANOVA進(jìn)行方差分析,兩兩間比較采用配對樣本t檢驗(yàn),多因素間比較應(yīng)用析因設(shè)計(jì)方差分析,方差齊時(shí)兩兩比較用SNK法,方差不齊時(shí)用Dunnett’s T3。數(shù)據(jù)以(±s) 表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成骨細(xì)胞鑒定倒置相差顯微鏡下,15 d左右骨塊周圍開始有細(xì)胞爬出,成長梭形,加入成骨誘導(dǎo)劑后細(xì)胞形態(tài)開始變得不規(guī)則,呈短梭形、三角形或多邊形。堿性磷酸酶染色,顯微鏡下觀可見大量染色呈陽性的細(xì)胞出現(xiàn),細(xì)胞胞漿中分布特征性的藍(lán)紫色細(xì)顆粒。成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)在鏡下可見部分細(xì)胞聚集呈“集落生長”,21 d后茜素紅染色呈紅色(見圖1~5)。

2.2不同濃度的不同藥物對成骨細(xì)胞增殖的影響

如圖6~7和表1結(jié)果所示,除了A組藥物,其他幾組藥物當(dāng)濃度為5%和10%時(shí),吸光度OD值逐漸增加,其中D組較明顯與5%濃度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);濃度為20%時(shí),吸光度OD值開始下降,其中D組和F組較明顯,與10%濃度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表現(xiàn)為對細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。10%濃度的各種藥物的含藥血清相對來說細(xì)胞的效應(yīng)最穩(wěn)定。

表1 不同藥物含藥血清對成骨細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 不同藥物含藥血清對成骨細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:**與5%組相比P<0.01;*與5%組相比P<0.05;△與10%組相比P<0.05。

Group OD殖5% 10% 20% A組 1.412±0.111 1.314±0.140 1.259±0098**B組 1.388±0.109 1.412±0.122 1.383±0.081 C組 1.231±0.097 1.349±0.113 1.272±0.164 D組 1.279±0.083 1.405±0.086* 1.284±0.185△E組 1.321±0.156 1.408±0.116 1.302±0.145 F組 1.347±0.145 1.383±0.291 1.189±0.135△

2.3不同藥物含藥血清對成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的影響

用10%藥物含藥血清處理細(xì)胞3 d后,不同藥物對BMP-2表達(dá)量的影響不同:A、B、E組較對照組平均值高,C、D、F組較對照組平均殖低;其中只有A、C(P<0.01)、E(P<0.05)組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示C組藥物可能有抑制骨形成蛋白表達(dá)的功能。

3 討論

AS是脊柱關(guān)節(jié)病中一種潛在高致殘類型,其患病率在各國報(bào)道不一,波動(dòng)在0.2%~1.4%[4],嚴(yán)重影響著患者的工作、學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量,給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。NSAIDs能夠迅速改善患者腰背部疼痛和發(fā)僵,減輕關(guān)節(jié)腫脹和疼痛及增加活動(dòng)范圍,是AS治療的一線用藥[5,6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約5億人在服用NSAIDs[7],但長期應(yīng)用不良反應(yīng)發(fā)生率的增高又限制了其應(yīng)用。有文獻(xiàn)[2]報(bào)告長期服用保泰松、塞來昔布等對脊柱結(jié)構(gòu)性破壞有防治作用,能延緩骨化。其機(jī)理可能是:COX-2受抑后,地諾前列酮降低,一方面會導(dǎo)致DKK-1上調(diào),Wnt/β-caten in信號通路受抑,從而使骨保護(hù)素生產(chǎn)減少;另一方面會抑制BMP,抑制成骨過程[8]。但是哪種抑制成骨作用最強(qiáng),還沒有文獻(xiàn)專門對NSAIDs各種藥物進(jìn)行對比性研究。本實(shí)驗(yàn)以此為目的,以期為臨床選藥提供依據(jù)。

NSAIDs是一大類非皮質(zhì)激素結(jié)構(gòu)類似,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗風(fēng)濕作用的藥物[9]。作者在實(shí)驗(yàn)前大量總結(jié)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),NSAIDs對骨代謝產(chǎn)生影響的機(jī)制可能為:抗炎機(jī)制,對體內(nèi)一些生物因子產(chǎn)生了作用,如前列腺素[10-12],從而改變了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的代謝;干擾血管的再生過程及某些骨形成通路[13]。其中前列腺素能通過加速成骨細(xì)胞的增殖和分化來刺激新骨形成,還能通過擴(kuò)張血管和促進(jìn)血管再生來為骨折端提供血液供應(yīng),而且這種影響主要是通過前列腺素E受體的2型和4型(EP2 和EP4)來介導(dǎo)的[14]。有研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs可通過抑制COX-2的表達(dá),阻止PG合成,從而抑制MSCs的游走、分化、增殖,阻斷其向成骨細(xì)胞分化[15]。還有實(shí)驗(yàn)顯示藥物可能會影響軟骨細(xì)胞形成和軟骨內(nèi)化骨,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性和骨形成[16]。骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族的一員,是一種多功能生長因子,主要位于骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨膜細(xì)胞和骨細(xì)胞內(nèi),BMP具有誘導(dǎo)成骨與促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力,其表達(dá)水平與骨形成活躍程度相關(guān)[17]。成骨細(xì)胞在骨代謝過程中發(fā)揮重要作用,其體外培養(yǎng)技術(shù)的成功使骨代謝的研究進(jìn)入細(xì)胞階段,人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)起始于20世紀(jì)80年代初期[18],主要來源為新生兒顱骨和成人松質(zhì)骨。血清藥理學(xué)由日本田代真一在1984年提出,其能客觀模擬藥物與機(jī)體相互作用的過程,克服藥物本身理化性質(zhì)對實(shí)驗(yàn)的影響,使用這種方法對成骨細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究,國內(nèi)外文獻(xiàn)均有報(bào)道[19]。

圖1 骨塊周圍有細(xì)胞爬出

圖2 加入成骨誘導(dǎo)劑前(A)后(B)細(xì)胞形態(tài)(×100)

圖3 成骨細(xì)胞ALP染色成藍(lán)色(×400)

圖4 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色大體圖 

圖5 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色(×100)

圖 6 不同濃度的藥物含藥血清對成骨細(xì)胞增殖的影響

圖7 不同藥物對成骨細(xì)胞骨形成蛋白的影響

本實(shí)驗(yàn)通過血清藥理學(xué)的方法來對比觀察幾種常見非甾體抗炎藥對成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響。選取臨床常用的非甾體抗炎藥(阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸鈉、美洛昔康、尼美舒利、塞來昔布)及生理鹽水,按照人-動(dòng)物體表面積換算劑量,予大鼠連續(xù)灌胃5次,第5次結(jié)束后1h采集大鼠血液制備含藥血清。以強(qiáng)直性脊柱炎患者全髖置換術(shù)中股骨松質(zhì)骨分離得到的成骨細(xì)胞為研究對象,實(shí)驗(yàn)分為含藥血清組和空白血清組。采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色來鑒定細(xì)胞,采用CCK-8法檢測各組血清對人成骨細(xì)胞增殖的影響及酶聯(lián)免疫法測對骨形成蛋白2的表達(dá)。結(jié)果顯示其隨著濃度的增加先增加后抑制,20%濃度時(shí)藥物抑制現(xiàn)象明顯,因此后面的實(shí)驗(yàn)適宜濃度定為10%。為對比觀察不同藥物對成骨細(xì)胞的影響,本實(shí)驗(yàn)選擇酶聯(lián)免疫法測骨形成蛋白2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,阿司匹林、布洛芬、尼美舒利組較對照組平均值高,雙氯芬酸、美洛昔康、塞來昔布組較對照組平均值低,其中雙氯芬酸鈉組較空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明其能抑制BMP-2的生成,可能是其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床發(fā)揮作用的機(jī)制之一。Krischak等人[20]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示雙氯芬酸鈉可以減少成骨細(xì)胞的數(shù)量,降低骨密度,延緩骨愈合。與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。但是缺少臨床實(shí)驗(yàn)。美洛昔康、塞來昔布較對照組無顯著性差異,意味著對BMP-2的效果類似,同李國青等人[21]對比,尼美舒利、美洛昔康及塞來昔布三種NSAIDs對活動(dòng)期AS患者疼痛緩解率及臨床療效的結(jié)果相似,無顯著性差異(P>0.05)。

然而,本實(shí)驗(yàn)作為一項(xiàng)探索性實(shí)驗(yàn),只納入了AS患者的細(xì)胞,采用的是血清藥理學(xué)研究,缺少正常細(xì)胞對照組、干擾因素多,在后續(xù)的研究中,將進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)細(xì)胞種類、改善給藥方式,進(jìn)行深入研究。且需進(jìn)行臨床對比觀察實(shí)驗(yàn),但臨床上患者的依從性很難把握,觀察周期長,借助人的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果來指導(dǎo)臨床的可行性更大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雙氯芬酸鈉的抑制效果較其他幾種藥物明顯,其治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)制可能與影響了骨形成蛋白表達(dá)有關(guān),但臨床個(gè)體差異較大,在有效安全的前提下可參照選藥。

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The influence of commonly used non-steroidal anti-inflammatory drug on osteoblast cell proliferation and bone morphogenetic protein

CHEN Jian1,TU Yong-gang1,LI Shan-wen2,ZHANG Pei3
(1.Changping Hospital,Dongguan,Guangdong 523560,China;2.Guzhen People's Hospital,Zhongshan,Guangdong 528421,China;3.TCM College,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong 510515,China)

ObjectiveTo investigate the influence of clinical commonly used several nonsteroidal anti-inflammatory drug-containing serum on osteoblast proliferation and bone morphogenetic protein expression,and to provide experimental evidence for clinical practice.M ethods To select commonly usednon-steroidal anti-inflammatory drugs in clinical(aspirin,ibuprofen,diclofenac,meloxicam,nimesulide,celecoxib)and saline,according to the human-animal body surface area dose,to fed rats five times in a row,after 1 hour of the fifth to collect rat blood serum.Osteoblasts for the study came from femoral cancellous bone of total hip arthroplasty in patients with ankylosing spondylitis,they were divided into groups containing serum and blank serum.Alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were used to identify the cells.The osteoblast cell proliferation was detected by CCK-8 assay.Enzyme-linked immunoassay was used to detect the expression of bone morphogenetic protein 2.ResultsConcentration of 20%of the drug-containing serum inhibited osteoblast cell proliferation,the effect of 10% serum containing was relatively most stable.Production of bone morphogenetic protein-2 was lower in diclofenac group,meloxicamtablets group,celecoxib group than the control group,and the difference between diclofenac group and control group was statistically significant.ConclusionThe influences of clinical commonly used several non-steroidal anti-inflam-matory on osteoblast proliferation and bone morphogenetic protein expression were different,the inhibitory effect of diclofenac sodium was the most obvious.The treatment mechanism of ankylosing spondylitis may be related with its affecting bone formation proteins.

non-steroidal anti-inflammatory drug;osteoblast cell;proliferation;bone morphogenetic protein/BMP-2

R971.91

A

1005-7234(2015)06-0459-05 DIO:10.3969/j.issn.1005-7234.2015.06.005

2015-08-17;

2015-09-17

廣東省東莞市科技局立項(xiàng)課題,編號:20131051010208

陳堅(jiān)(1964-),男,江西籍,副主任醫(yī)師

研究方向:創(chuàng)傷骨科,脊柱外科

屠永剛

電話:15899631143

電子郵箱:94665961@qq.com

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