馬麗，代科，曾婷，黃仕穩(wěn)，鞠鶴鵬

（廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510507）

HPLC同時(shí)測定多種食品添加劑的不確定度評定

馬麗，代科，曾婷*，黃仕穩(wěn)，鞠鶴鵬

（廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州510507）

建立高效液相色譜（HPLC）法測定灌裝紅腰豆中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉含量的不確定度方法。通過建立數(shù)學(xué)模型，確定影響不確定度的因素，分析各不確定度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。樣品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉含量測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.028 7、0.017 3、0.127 9 mg/kg，擴(kuò)展不確定度分別為0.057 4、0.034 7、0.255 8 mg/kg。本研究方法可為HPLC法測定灌裝紅腰豆中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉含量的不確定度評估提供參考。

HPLC；測量不確定度；食品添加劑；合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；擴(kuò)展不確定度

近年來，以防腐劑、甜味劑以及香精為代表的食品添加劑已經(jīng)被大量的運(yùn)用到食品生產(chǎn)加工和方便食品當(dāng)中［1］。因此在中國，這些食品添加劑被食品安全標(biāo)準(zhǔn)限制，這對于食品檢驗(yàn)工作提出了較高的要求，尤其對于這些含量較低的物質(zhì)，檢測結(jié)果的真實(shí)性更是至關(guān)重要，測量不確定度能很好的反映測量結(jié)果的質(zhì)量，因此對于不確定的研究具有一定意義。

我國于1999年制定了中華人民共和國計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF1059—99《測量不確定度評定與表示》［2］。根據(jù)國際通用計(jì)量學(xué)基本術(shù)語，測量不確定度的定義為：表征合理地賦予被測量之值的分散性與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)［3］。在實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果中，由于測量誤差的存在，而對被測量值不能確定的程度，表示誤差可能存在的范圍，表征結(jié)果的可信賴程度，它能更加準(zhǔn)確的體現(xiàn)測量結(jié)果的分散性。

本研究根據(jù)國標(biāo)GB/T 23495-2009［4］《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定（HPLC）》相關(guān)要求和方法，對測量過程中可能影響測量結(jié)果的因素進(jìn)行不確定度評價(jià)和分析。

1材料和方法

1.1儀器與試劑

Waterse2695HPLC：美國Waters公司；Waters2998二極管陣列檢測器，Empower software色譜工作站；AB204-L萬分之一電子天平：METTLER TOLEDO；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；SIGMA 3K15離心機(jī)：德國；KQ-600型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

苯甲酸鈉、山梨酸鉀、糖精鈉；乙酸鋅、乙酸銨、亞鐵氰化鉀均為分析純；甲醇為色譜純。

1.2色譜條件

色譜柱：XBridge C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇+乙酸銨溶液（0.02 mol/L）=15∶85，乙酸銨溶液：稱取1.56 g標(biāo)準(zhǔn)品，用純水定容至1 000 mL；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3溶液的配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

準(zhǔn)確稱取苯甲酸鈉0.236 0 g、山梨酸鉀0.268 0 g、糖精鈉0.170 2 g，分別加水溶解并定容至200 mL。所得標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度均為1 mg/mL。

1.3.1.2苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制

各取苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于2個(gè)100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，兩種溶液每毫升相當(dāng)于含標(biāo)準(zhǔn)品10 μg。另取糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于含糖精鈉100 μg。

1.3.1.3單標(biāo)的配置

分別吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)稀釋液各1.0 mL于3個(gè)25 mL容量瓶中，定容至刻度，3種單標(biāo)溶液的濃度分別為苯甲酸0.4 μg/mL、山梨酸0.4μg/mL、糖精鈉4.0 μg/mL。

1.3.1.4混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置

準(zhǔn)確吸取不同體積的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)稀釋液于6個(gè)10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，配置成苯甲酸、山梨酸濃度分別為0.02、0.30、0.40、0.50、0.80、1.00 μg/mL，糖精鈉濃度為2.00、3.00、4.00、5.00、8.00、10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2樣品的處理

1.3.2.1樣品制備及預(yù)處理

取灌裝紅腰豆作為檢驗(yàn)樣品，將樣品搗碎，再經(jīng)高速組織均質(zhì)機(jī)均質(zhì)備用。

1.3.2.2樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取2.500 g上述預(yù)處理好的樣品于小燒杯中，用20 mL水分?jǐn)?shù)次清洗小燒杯將樣品移入25 mL容量瓶中，超聲震蕩提取5 min，取出過后加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入2 mL乙酸鋅溶液，搖勻，用水定容至刻度。移入離心管中，4000r/min離心5min，吸出上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.4測定方法

儀器打開預(yù)熱，按實(shí)驗(yàn)條件平衡30 min以上，待基線平穩(wěn)后，樣品依次進(jìn)樣，以其單標(biāo)液峰保留時(shí)間為依據(jù)定性，記錄各峰面積值。

1.5測定結(jié)果

單標(biāo)溶液結(jié)果苯甲酸、山梨酸、糖精鈉峰保留時(shí)間分別為6.502、8.338、7.341 min。

2數(shù)學(xué)模型與不確定度計(jì)算公式

2.1數(shù)學(xué)模型

2.1.1工作曲線

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y= 5 323.0x+1 485.8（R2=0.999 956）、y=96 297.7 x-754.1（R2=0.999 981）、y=4 078.0 x-2 314.7（R2=0.999 915）。

2.1.2樣品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉計(jì)算公式

式中：X為樣品中待測組分含量，（g/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中待測物的濃度，（mg/mL）；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2.1.3樣品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉計(jì)算結(jié)果

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出：①樣品溶液中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的濃度分別為0.254、0.214、1.64 μg/mL；②加標(biāo)樣品溶液中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉濃度分別為0.641、0.600、5.37 μg/mL；③定容體積為25 mL，樣品質(zhì)量為2.5 g，因此可得知樣品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量分別為2.54、2.14、16.4 mg/kg。

2.2測量相對不確定度計(jì)算公式［6］

式中：u（c，rel）為樣品中苯甲酸/山梨酸/糖精鈉濃度的相對不確定度；urel（1）為苯甲酸/山梨酸/糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及配制引起的相對不確定度；urel（2）為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度-峰面積值擬合的工作曲線求苯甲酸/山梨酸/糖精鈉含量時(shí)產(chǎn)生的相對不確定度；urel（3）為重復(fù)測定樣品產(chǎn)生的相對不確定度，即A類不確定度；urel（4）為試樣稱量引入的相對不確定度；urel（5）為樣品溶液定容體積引入的相對度；urel（6）為加標(biāo)回收率引起的相對不確定度。

3測量相對不確定度各分量的計(jì)算

3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的相對不確定度（以苯甲酸0.5μg/mL、山梨酸0.5μg/mL、糖精鈉5.0μg/mL配制為例）urel（1）由以下6個(gè)分量組成。

3.1.1標(biāo)準(zhǔn)品稱量引起的相對不確定度urel，w（標(biāo)）

主要包括標(biāo)準(zhǔn)品純度、天平稱量示值以及天平稱量重復(fù)性引起的不確定度［5］。

3.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度uw（標(biāo)a）

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品的純度分別為：99.0%、99.8%、99.9%，假定分布區(qū)間為0.05%，取K=，則相對不確定度：苯甲酸=0.000 29，山梨酸= 0.000 29，糖精鈉=0.000 29。

3.1.1.2天平稱量準(zhǔn)確性引起的不確定度uw（標(biāo)b）

AB204-L電子天平，檢定證書給出的最大允差為0.000 2 g，假設(shè)為均勻分布，則u（標(biāo)b）=0.000 2/31/2= 0.000 115 g。

3.1.1.3天平稱量重復(fù)性的不確定度uw（標(biāo)c）

AB204-L電子天平，檢定證書給出的重復(fù)性誤差為±0.001 1 g，假設(shè)為均勻分布，則uw（標(biāo)c）=0.001 1/31/2= 0.000 635 g。

3.1.1.4天平稱量引起的相對不確定度

uw（標(biāo)）=［（uw（標(biāo)a））2+（uw（標(biāo)b））2+（uw（標(biāo)c））2］1/2，則苯甲酸、山梨酸、糖精鈉稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.003 0、0.0026、0.00413.1.2200mL量瓶（V1）的相對不確定度urel，v1（標(biāo)）包括3部分：（1）量瓶體積的不確定度，根據(jù)常用玻璃量器計(jì)量檢定規(guī)定［6］可知，A級200mL量瓶的允差為±0.15mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.087 mL；（2）定容時(shí)的估讀誤差，用該容量瓶重復(fù)吸取蒸餾水10次，并稱量計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020 mL；（3）量瓶和溶液的溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度［7］，但是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度大致在25℃，容量瓶的校準(zhǔn)溫度為20℃，則環(huán)境溫度引起的不確定度為

以上3項(xiàng)合成得出

200mL量瓶（V1）的相對不確定度：urel，v1（標(biāo)）=0.000 75

3.1.31mL移液管體積（V2）的相對不確定度urel，v2（標(biāo)）

包括3個(gè)部分：（1）移液管體積的不確定度，根據(jù)常用玻璃量器計(jì)量檢定規(guī)定可知，A級1 mL移液管的允差為±0.007 mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為；（2）吸取溶液時(shí)讀數(shù)誤差，估計(jì)為±0.005 mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.005/；（3）移液管和溶液溫度與校正時(shí)溫度不同引起的體積不確定度為（實(shí)際溫差為5℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃），移液管因環(huán)境溫度校正不同引起的體積不確定度為61 mL。

以上3項(xiàng)合成得出：

1mL移液管（V2）的相對不確定度：urel，v2（標(biāo)）=0.0050 3.1.4100 mL（糖精鈉為10 mL）容量瓶體（V3）的相對不確定度urel，v3（標(biāo)）

按100mL計(jì)算，包括3部分：（1）量瓶體積的不確定度，根據(jù)常用玻璃量器計(jì)量檢定規(guī)定可知，A級100 mL量瓶的允差為±0.10 mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為；（2）定容時(shí)的估讀誤差，用該容量瓶重復(fù)吸取蒸餾水10次，并稱量計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.018 mL；（3）量瓶和溶液的溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度為100×2.1×10-4×5/

以上3項(xiàng)合成得出：

100mL量瓶（V3）的相對不確定度：urel，v3（標(biāo)）=0.000 86 3.1.51 mL移液管吸取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的體積（V4）的相對不確定度urel，v4（標(biāo)）

如“4.1.3”計(jì)算，urel，v4（標(biāo)）=0.005 0。

3.1.610mL容量瓶的體積（V5）的不確定度urel，v5（標(biāo)）

包括3部分：（1）量瓶體積的不確定度，根據(jù)常用玻璃量器計(jì)量檢定規(guī)定可知，A級10 mL量瓶的允差為±0.02 mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 mL；（2）定容時(shí)的估讀誤差，用該容量瓶重復(fù)吸取蒸餾水10次，并稱量計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006 mL；（3）量瓶和溶液的溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度為

以上3項(xiàng)合成得出：

10mL量瓶（V5）的相對不確定度：urel，v5（標(biāo)）=0.001 5

綜上所述，

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及配制引起的相對不確定度分別為0.007 9、0.007 8、0.006 9

3.2苯甲酸/山梨酸/糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引起的不確定度

工作曲線數(shù)據(jù)表如表1、表2、表3所示。

urel（1）計(jì)算公式表示為：

表1　苯甲酸濃度的不確定度工作曲線數(shù)據(jù)Table 1Benzoic acid concentration of working curve data uncertainty

表2　山梨酸濃度的不確定度工作曲線數(shù)據(jù)Table 2The uncertainty of sorbic acid concentration in the working curve data

式中：n為測試標(biāo)準(zhǔn)溶液次數(shù)，n=6×3=18；P為測試樣品溶液次數(shù)，P=7為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，x苯=0.533，x山=0.533，x糖=5.33；x′為樣品溶液濃度的平均值；b為工作曲線的斜率，b苯=5323.0，b山=96 297.7，b糖=4 078.0。

表3　糖精鈉濃度的不確定度工作曲線數(shù)據(jù)Table 3The uncertainty of saccharin sodium concentration in the working curve data

7次測量所得樣品中苯甲酸濃度分別為：0.254、0.255、0.252、0.254、0.257、0.255、0.254 μg/mL，平均濃度為0.254 μg/mL；山梨酸濃度均為0.214 μg/mL，平均濃度為0.214 μg/mL；糖精鈉濃度分別為1.642、1.644、1.635、1.637、1.637、1.640、1.643、1.640 μg/mL，平均濃度為1.640 μg/mL。

樣品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量為x苯= 0.254×25/2.5=2.54 mg/kg；x山=0.214×25/2.5=2.14 mg/kg；x糖=1.640×25/2.5=16.40 mg/kg。

3.3高效液相色譜儀測量重復(fù)性引起的不確定度（即A類不確定度urel（3））即重復(fù)測定樣品產(chǎn)生的相對不確定度數(shù)據(jù)見“1.5.3”項(xiàng)。單次測量相對不確定度

則苯甲酸、山梨酸、糖精鈉單次測量引起的不確定度分別為0.002 1、0.000 30、0.000 81

3.4樣品稱量引入的相對不確定度urel（4）

主要由電子天平稱量準(zhǔn)確性引起的不確定度uw（標(biāo)b）和稱量重復(fù)性的不確定度uw（標(biāo)c），分別按“4.2.1.2”和“4.2.1.3”計(jì)算，則urel（4）=0.000 26

3.5樣品溶液定容體積引入的不確定度urel（5）

本次試驗(yàn)樣品溶液定容采用的是25 mL容量瓶，25 mL容量瓶的相對不確定度urel（5）主要包括三個(gè)部分：①容量瓶體積的不確定度u（5）1，根據(jù)JJG196-2006計(jì)量檢定規(guī)程，25 mL量瓶允許誤差為±0.03 mL，按三角分布，則；②容量瓶重復(fù)性引入的不確定度u（5）2：屬A類不確定度，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得u（5）1=0.021mL；③容量瓶因溫度不同產(chǎn)生的不確定度u（5）3，在空調(diào)條件下，設(shè)室溫為（25±2）℃，溶劑水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布，包含因子，則環(huán)境溫度引入的不確定度為u（5）3=0.006 1。

合成以上三項(xiàng)得

3.6回收率產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（6）［8］：

3.6.1苯甲酸回收率測得的結(jié)果：為95.99%、95.92%、97.41%、97.29%、95.99%、96.11%、97.07%，平均回收率為96.54%?；厥章十a(chǎn)生的不確定度為u（6）l=，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=u（6）l/P%=0.007 1。

3.6.2山梨酸為96.46%、96.72%、96.45%、96.72%、96.60%、96.54%、96.48%，平均回收率為96.57%?；厥章十a(chǎn)生的不確定度u（6）l=0.001 2，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=u（6）l/P%=0.001 2。

3.6.3糖精鈉為93.00%、93.08%、93.15%、93.36%、93.28%、92.99%、93.29%，平均回收率為93.16%。回收率產(chǎn)生的不確定度=0.0015，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=u（6）l/P%=0.0016。

4苯甲酸/山梨酸/糖精鈉相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.011 3、0.008 1、0.007 8

5擴(kuò)展不確定度分析

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（c）=u（c，rel）×，u（c）l=0.0113×2.54= 0.028 7 mg/kg；u（c）l=0.008 1×2.14=0.017 3 mg/kg；u（c）l=0.007 8×16.40=0.127 9 mg/kg

取置信概率P=95%，則置信區(qū)間K=2，擴(kuò)展不確定度U=u（c）×K=u（c，rel）×x×K，U苯=0.011 3×2.54×2= 0.057 4 mg/kg；U山=0.008 1×2.14×2=0.034 7 mg/kg；U糖=0.007 8×16.40×2=0.255 8 mg/kg

6結(jié)論

1）影響本實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果的主要因素為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及回收率，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制影響最大，而在這一過程中標(biāo)準(zhǔn)品的稱量和移液管移取溶液所占比重最大。

2）本試驗(yàn)同時(shí)評定同一樣品的3種成分含量測定結(jié)果的不確定度，從試驗(yàn)結(jié)果分析，糖精鈉的測量不確定度較大，苯甲酸、山梨酸次之，最大的影響因素是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

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The Evaluation of Measurement Uncertainty for Varieties of Food Additives by HPLC Synchronously

MA Li，DAI Ke，ZENG Ting*，HUANG Shi-wen，JU He-peng
（Centers for Disease Control and Prevention of Guangzhou Military Region，Guangzhou 510507，Guangdong，China）

To establish a method of uncertainty evaluation for the determination of benzoic acid，sorbic acid and soluble saccharin from the red beans by HPLC.By establishing a mathematical model to determine the factors affecting the uncertainty and the analysis of the effect of the uncertainty of the experimental results.Results showed determination of benzoic acid，sorbic acid，soluble saccharin content in the sample of the synthetic standard uncertainty were 0.028 7，0.017 3，0.127 9 mg/kg，the expanded uncertainty were 0.057 4，0.034 7，0.255 8 mg/kg.This method can be used in HPLC determination of benzoic acid，sorbic acid and soluble saccharin in the red beans of uncertainty evaluation.

HPLC；easurement ncertainty；food additives；synthetic standard uncertainty；expanded uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.008

2013-12-12

馬麗（1971—），女（漢），高級工程師，本科，從事食品理化檢驗(yàn)工作。

曾婷，碩士研究生，助理研究員。