金熒熒　孫燕雯　何昱

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

·研究報告·

不同產(chǎn)地市售紅花藥材指紋圖譜的建立*

金熒熒孫燕雯何昱△

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

目的建立紅花藥材的高效液相（HPLC）特征指紋圖譜分析方法，為評價和有效控制紅花藥材的質(zhì)量提供借鑒。方法收集12批次不同產(chǎn)地的市售紅花藥材，進行HPLC梯度洗脫分離，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件處理數(shù)據(jù)，建立紅花指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地紅花藥材指紋圖譜的相似度進行比較分析。結(jié)果建立了紅花藥材的HPLC指紋圖譜，標定了25個共有峰，且通過HPLC-MS指認了其中4個共有峰。對12批不同產(chǎn)地的紅花藥材指紋圖譜進行了相似度評價，其相似度在0.679～0.985之間。結(jié)論所建立的指紋圖譜可為紅花藥材的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)，并為紅花的體內(nèi)藥動學研究提供參考。

不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜HPLC

紅花味辛微苦、性溫，歸心、肝經(jīng)，是活血通經(jīng)、祛瘀止痛之良藥，主要用于治療心腦血管類疾病及糖尿病并發(fā)癥等［1］。紅花原植物為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.，主要分布在河南、浙江、四川、云南、新疆等地［2］。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，市售紅花藥材在化學組成上存在一定的差異，而已有指紋圖譜的研究報道有的藥材產(chǎn)地較為局限［3］，有的構(gòu)建的指紋圖譜共有峰較少［4］，難以對紅花藥材的質(zhì)量作出全面客觀的評價。故本研究收集了全國各地市售的紅花藥材共12批，建立了紅花水提液的高效液相（HPLC）指紋圖譜，標定25個共有峰，并對不同產(chǎn)地紅花藥材指紋圖譜的相似度進行評價，較為客觀地反映了藥材的內(nèi)在質(zhì)量；同時為課題項目的下一步，即進行體內(nèi)多組分的檢測、建立體內(nèi)指紋圖譜，以全面探討紅花的體內(nèi)過程提供了參考依據(jù)。

1　實驗材料

12個不同批次的紅花藥材購自全國各藥店，由浙江中醫(yī)藥大學陳孔榮副教授鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具體產(chǎn)地及批號為：S1新疆塔城，批號121205；S2新疆伊犁，批號120804；S3甘肅酒泉，批號120804；S4新疆哈密，批號121024；S5四川南充，批號100925；S6河南，批號120928；S7四川，批號121009；S8云南，121021；S9新疆伊寧，批號21007；S10新疆昌吉，批號120523；S11新疆阿克蘇，批號120523；S12內(nèi)蒙古固陽，批號121011。羥基紅花黃色素A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111637-201106），三氟乙酸（科龍化工試劑廠分析純，批號20110906），乙腈（美國TEDIA公司，色譜純），水為Millipore超純水。Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Millipore純水儀（美國Millipore公司）；AL104電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2　.實驗方法

2.1色譜條件Alltech Alltima-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，2%A；5～10 min，2%～5%A；10～20 min，5%～11%A；20～30 min，11%～12%A；30～70 min，12%～43%A；70～72 min，43%～2%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30°C；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL［4-6］。

2.2供試品溶液的制備精密稱取0.5 g紅花樣品，加入水15 mL，精密稱定，60℃溫浸提取45 min，冷卻后補充丟失的水分，取濾液過0.22 μm濾膜，即得紅花水提供試品溶液。

2.3參照物的選擇羥基紅花黃色素A（HSYA）在紅花的水溶性成分中含量最高，為紅花的主要活性成分之一，是檢驗紅花品質(zhì)的指標性成分［7］。在色譜洗脫過程中，HSYA的色譜峰較為明顯，并出現(xiàn)在色譜圖的中間段，故本試驗選用HSYA為參照物。精密稱取HSYA對照品5.0 mg，加25%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得0.50 mg/mL的對照品溶液。精密吸取對照品溶液20 μL，按上述色譜條件進行分析，記錄保留時間用以確定指紋圖譜中參照物的位置。

2.4方法學考察

2.4.1精密度試驗精密稱取S10的紅花樣品0.5 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定記錄色譜圖，以參照峰的保留時間（25.62 min）和峰面積為參比，計算供試品溶液中各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2.4.2重復(fù)性試驗取S10的樣品平行制備6份供試品溶液，按“2.1色譜條件”進行HPLC分析，以參照峰的保留時間和峰面積為參比，計算供試品溶液中各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2.4.3穩(wěn)定性試驗S10的藥材供試品溶液在制備好后室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進行HPLC分析，以參照峰的保留時間和峰面積為參比，計算供試品溶液中各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2.5紅花藥材指紋圖譜的建立分別精密吸取各產(chǎn)地的紅花供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄72 min的色譜圖，建立樣品的HPLC指紋圖譜。

2.6不同產(chǎn)地紅花藥材對照圖譜的建立將所得的12個不同產(chǎn)地紅花藥材的HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件，對各產(chǎn)地紅花藥材供試品溶液的峰數(shù)、峰面積和保留時間等相關(guān)參數(shù)進行分析，相比于其他11批紅花藥材，S10的紅花藥材HPLC圖譜中各組分的色譜峰分離度更高，主要組分峰形良好，因此以S10圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.1 s，進行多點校正，譜峰匹配后以中位數(shù)法生成對照圖譜。確定參照峰位置，計算各共有峰的相對保留時間（共有峰與參照峰的保留時間的比值）和相對峰面積（共有峰與參照峰的峰面積的比值）。

2.7不同產(chǎn)地紅花藥材相似度評價通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件中的“相似度計算”功能進行供試品色譜圖譜與對照圖譜的相似度評價。

3　結(jié)果

3.1方法學考察見表1，表2。

3.1.1精密度試驗各共有峰相對保留時間的RSD在0.033%～0.200%之間，相對峰面積的RSD在0.319%～2.769%之間，表明儀器穩(wěn)定，符合精密度要求。

3.1.2重復(fù)性試驗各共有峰相對保留時間的RSD在0.073%～0.801%之間，相對峰面積的RSD在0.621%～2.928%，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.3穩(wěn)定性試驗24 h內(nèi)供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.030%～0.351%之間，相對峰面積的RSD在1.258%～3.076%之間，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2共有峰的標定將不同產(chǎn)地的市售紅花藥材制成供試溶液，按上述色譜條件進行分析，對12批樣品的指紋圖譜比較，其中25個峰是全部樣品所共有的（峰號見圖2），并且含量相對較高，各成分之間分離效果良好，確定為共有指紋峰。3號峰的峰形較寬；9號峰為最高峰；11與12號峰，15與16號峰緊密相連，分離不好時出現(xiàn)M峰；13號峰峰形較寬。將樣品與HSYA的HPLC圖譜進行比較，9號峰與參照峰一致，故確定9號峰為參照峰，記為S。

3.3紅花藥材的HPLC指紋圖譜的建立以9號HSYA參照峰峰面積作1，計算各共有峰的保留時間及峰面積與參照峰的比值，結(jié)果見表1及表2，并建立紅花水提物的HPLC指紋圖譜（圖1）。

圖1　紅花藥材HPLC指紋圖譜

3.4紅花藥材對照圖譜的建立運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對12批紅花指紋圖譜進行分析，以25個共有峰為校正點，建立紅花藥材的對照圖譜，如圖2所示。

表1　紅花藥材指紋圖譜共有峰（示相對保留時間）

圖2　紅花藥材的對照圖譜

3.5紅花藥材相似度計算以紅花藥材的對照圖譜為標準，以軟件計算得到的12批不同產(chǎn)地樣品的相似度分別為0.908、0.967、0.945、0.981、0.950、0.979、0.969、0.975、0.883、0.951、0.679、0.985。

4　討論

4.1指紋圖譜建立條件的選擇與優(yōu)化首先比較了3種不同品牌不同型號的色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），AgilentEclipseXDBC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Alltech Alltima-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。結(jié)果顯示Alltech Alltima-C18色譜柱對紅花水溶性成分的分離效果最佳。其次對流動相中的酸進行了考察，包括磷酸、甲酸、乙酸和三氟乙酸，結(jié)果表明三氟乙酸對紅花水提物中某些較難分離的組分分離效果良好，且峰形也較好。然后對檢測波長也進行了考察，分別為210 nm、254 nm、280 nm和403 nm，其中在210 nm和280 nm條件下出峰數(shù)最多，但是相對而言280 nm條件下各個成分的峰形較好，分離度較高，因此選擇280 nm為檢測波長。

4.2紅花藥材的HPLC-MS分析Fan Li等［8］分離純化了紅花藥材中的10種組分，并通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）對其進行了分子量的測定。為確定這10個組分是否在圖2的共有峰中出現(xiàn)，采用HPLCMS對紅花水提物進行了分析。

共有峰相對峰面積均數(shù)新疆塔城新疆伊犁甘肅酒泉新疆哈密四川南充河南四川云南新疆伊寧新疆昌吉新疆阿克蘇內(nèi)蒙古固陽10.12260.13140.14620.08260.14500.04620.10890.09030.10110.11650.07020.05160.1010 20.10280.09760.14250.08870.13320.11040.08630.10480.06240.09620.06690.08500.0981 30.06230.04110.04610.02450.06400.05450.02510.02960.02500.02850.02950.08500.0429 40.16200.05940.11570.08460.14870.13870.08800.07820.15140.11290.19170.11710.1207 50.14480.17880.24980.12960.20460.20410.16790.14970.15050.18190.14990.18920.1751 60.10110.06010.10180.06390.10770.09080.05190.06790.07170.09550.09650.07200.0817 70.16110.07550.12950.11030.16780.09600.07210.12740.58360.12660.08411.58580.2767 80.21710.09790.17260.17890.21910.13270.09500.17910.14420.19200.12800.16500.1601 91.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000 100.26770.15790.30260.21890.42430.25510.14010.22410.19920.30500.22260.25100.2474 110.28270.10160.21810.12460.33730.18000.09310.13540.16820.19960.20320.13860.1819 120.14340.10240.14830.13460.16680.14980.14760.14930.09690.11500.09730.12310.1312 130.20480.06070.15070.09880.19460.12400.05150.09900.03970.10360.04520.02170.0995 140.13360.08330.08280.07850.09240.07040.06320.08650.06280.07920.06050.06240.0796 150.15640.08030.14940.10560.19110.12680.08530.10710.10660.13060.14760.09660.1236 160.06600.05290.05290.11410.08730.05320.06440.08860.04710.06440.06410.05800.0677 170.16140.10520.12950.13700.07250.22060.09080.15860.16540.15250.17830.13620.1423 180.19510.11610.12400.16640.38780.2780 0.1203 0.21060.18880.13670.22720.20240.1961 190.13270.06100.12470.05590.38780.1034 0.0482 0.06340.10540.11520.12120.07330.1160 200.23390.11910.10260.10770.02100.1778 0.0957 0.13680.02490.17210.03870.03390.1053 210.73580.21030.24960.36340.64660.2951 0.2045 0.33550.04550.38380.09510.14050.3088 220.76290.38490.54650.45530.59830.4862 0.3853 0.47670.35130.45580.40330.40790.4762 230.13810.14300.20710.17190.12280.2317 0.1319 0.19330.14520.28930.17440.12670.1729 240.09060.06700.04740.10780.20360.0929 0.0612 0.10540.03370.04820.03070.04050.0774 250.04840.10380.03290.04570.05540.0811 0.0586 0.04210.07310.03670.06540.07410.0598

圖3　紅花藥材質(zhì)譜圖

根據(jù)液質(zhì)結(jié)果（見圖3），確定在25個共有峰中存在的是鳥苷（5號峰），羥基紅花黃色素A（9號峰），6-羥基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷（18號峰）及脫水紅花黃色素B（22號峰）。

4.3不同產(chǎn)地市售紅花藥材相似度評價12個不同產(chǎn)地的市售紅花藥材中，除產(chǎn)地9和11樣品外，其余10個產(chǎn)地的藥材相似度均大于0.9，具有較好的一致性。而來自產(chǎn)地9（新疆伊寧）和產(chǎn)地11（新疆阿克蘇）的紅花藥材其相似度僅為0.883和0.679，從外觀上看這兩個產(chǎn)地的紅花顏色較深，其中產(chǎn)地11的紅花還摻雜少量泥土。原因可能是這兩個產(chǎn)地的紅花藥材的生長年限、環(huán)境等因素對藥材的內(nèi)部質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響，或者在藥材的采摘、加工、儲藏、運輸?shù)确矫娴牟划敳僮魇蛊滟|(zhì)量有所降低。

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The Establishment of HPLC Fingerprint of Commercial Safflower from Different Producing Areas

JIN Yingying，SUN Yanwen，HE Yu.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China

Objective：To develop a HPLC fingerprint method for the quality control of safflower，which offers a reliable method to scientifically evaluate and effectively control the quality of safflower.Methods：12 batches of safflower from different areas were collected，and the gradient elution mode was applied in HPLC chromatographic separation.Data was analyzed by the software"Chromatographic fingerprint evaluation system"in 2004A Edition to establish fingerprint and compare the quality of safflower samples from different habitats.Results：The HPLC fingerprint spectrum of safflower was set up.There were 25 common peaks in safflower，and four of them were identified by HPLC-MS.The similarity evaluation of 12 areas of safflower was carried out，and their similar degrees were between 0.679～0.985.Conclusion：The fingerprint spectrum may provide the basis for quality control of safflower，and supply analysis condition for the study of pharmacokinetics of safflower in vivo.

Different producing areas；Safflower；Fingerprint；HPLC

R282

A

1004-745X（2015）09-1513-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.003

2015-06-27）

國家自然科學基金項目（81373898）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目

（電子郵箱：heyu0923@sina.com）