王果　陳翔

（1.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州310000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院康復(fù)中心，浙江溫州325000）

·研究報(bào)告·

芹菜素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響*

王果1陳翔2△

（1.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州310000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院康復(fù)中心，浙江溫州325000）

目的探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）在大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間的表達(dá)變化及芹菜素對(duì)其表達(dá)的影響。方法采用改良線栓法建立大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間損傷模型。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芹菜素組和地塞米松組，各手術(shù)組按再灌注時(shí)間不同又分為再灌注6 h組、24 h組、72 h組、7 d組4個(gè)亞組。各組麻醉清醒后均給予神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，每組1只，大鼠予2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色觀察腦梗死灶，6只免疫組化法測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)。結(jié)果在芹菜素72 h組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于模型72 h組（P＜0.05）；各手術(shù)組均出現(xiàn)白色梗死灶；缺血再灌注后TGF-β1表達(dá)增加，于24、72 h達(dá)高峰，芹菜素組能顯著提高TGF-β1的表達(dá)，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論芹菜素可增加腦缺血再灌注后TGF-β1的表達(dá)，提示芹菜素可能通過(guò)TGF-β1促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)，達(dá)到神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。

芹菜素腦缺血再灌注2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

腦卒中嚴(yán)重危害人類的健康，卒中時(shí)的腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，造成神經(jīng)功能的不同程度的損害［1］。對(duì)其損傷及修復(fù)治療過(guò)程一直是研究的熱點(diǎn)。腦缺血再灌注時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）表達(dá)增加［2］。TGF-β1是具有多重調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，其生物學(xué)作用復(fù)雜多樣，并依據(jù)不同的細(xì)胞類型和病理環(huán)境發(fā)生變化。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為T(mén)GF-β1可促進(jìn)神經(jīng)元生存，促進(jìn)其分化，增加神經(jīng)元的軸突數(shù)目，并具有加速神經(jīng)組織修復(fù)的作用［3］。芹菜素（APG）是一種來(lái)源廣泛的植物黃酮，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種活性［4］。課題組前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芹菜素可通過(guò)抑制NF-κB的活化、減少iNOS的產(chǎn)生及缺血半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化［5］，而抑制缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1的表達(dá)，及芹菜素是否能通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)一步參與再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的損傷和修復(fù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD大鼠共91只，體質(zhì)量（250±20）g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SYXK（浙）2005-0061。

1.2藥物與試劑芹菜素（陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：HK20081218）、地塞米松磷酸鈉注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：0901055），2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色購(gòu)自sigma公司（批號(hào)：000298964），TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：BA0290）；即用型SABC快速免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：SA1028）。

1.3儀器德國(guó)LEICA公司CM1900冰凍切片機(jī)；日本Olympus公司BX41光學(xué)顯微鏡；美國(guó)Media Cybernetics公司Image-Pro Plus 6.0（IPP6.0）彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)；尼龍栓線購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品號(hào)：2636-A3）。

1.4分組與造模將大鼠隨機(jī)分為模型組、芹菜素組和地塞米松組，各28只，再按按再灌注時(shí)間分為再灌注6 h組、24 h組、72 h組、7 d組4個(gè)亞組，每個(gè)亞組各7只，另取7只為假手術(shù)組。參照Belayev［6］報(bào)道的線栓法進(jìn)行改良，建立急性大腦中動(dòng)脈栓塞和再灌注模型。缺血2 h后將栓線退回到頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組栓線只插到頸內(nèi)、外動(dòng)脈的分叉處。

1.5給藥方法各組于造模再灌注同時(shí)及其后的每隔24 h分別腹腔注射給藥，芹菜素組劑量為25 mg/kg（0.8 mL/100 g）、地塞米松組劑量為5 mg/kg（0.8 mL/ 100 g），假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分阻斷血流1 h后參照Z(yǔ)ea Longa［7］5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：0分為無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)受到抑制；5分為死亡。

1.6.2腦組織切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色各組隨機(jī)取1只觀察至再灌注后24 h，用10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室迅速灌注冰生理鹽水150 mL，快速斷頭取腦，以2 mm間距冠狀切成6片，浸在2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑緩沖液中，置37℃的水浴箱中避光染色30 min，再在4%的多聚甲醛中固定過(guò)夜，數(shù)碼相機(jī)拍照觀察。

1.6.3免疫組織化學(xué)觀察TGF-β1的表達(dá)各亞組大鼠6只觀察至規(guī)定的時(shí)間后，灌注固定后取腦，冠狀切取前囟前1.0 mm至前囟后2.0 mm的左半球腦組織，置4%多聚甲醛中后固定2 h，再置30%蔗糖中4℃冰箱過(guò)夜至組織沉底，OCT包埋液氮速凍后移入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫槐鶅銮衅瑱C(jī)冠狀連續(xù)切片，8 μm厚，每隔10張取1張，每只大鼠取5張切片。檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。封片后，自然晾干，并盡快觀察與攝片。圖片放大倍數(shù)表示物鏡倍數(shù)乘目鏡放大倍數(shù)。每只大鼠取免疫組化切片5張，置于高倍鏡下（400倍），每張切片于腦缺血梗死區(qū)周圍隨機(jī)選取陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域5個(gè)非重疊視野攝片后，用美國(guó)IPP6.0分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的OD值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett’T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠缺血再灌注后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較見(jiàn)表1。模型組在腦缺血再灌注后7 d神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較再灌注6 h減?。≒＜0.05）；芹菜素組在腦缺血再灌注后7 d神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較再灌注6 h、再灌注24 h減?。≒＜0.05），在再灌注72 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于模型再灌注72 h組（P＜0.05）；地塞米松組在再灌注7 d神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較本組再灌注6 h、24 h有減?。≒＜0.05）；余各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

表1　各組大鼠缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

與模型組同時(shí)間比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組6 h時(shí)比較，■P＜0.05；與本組24 h組比較，◆P＜0.05。下同。

組別n 再灌注6 h再灌注24 h再灌注72 h再灌注7 d模型組7芹菜素組7 2.3452±0.8175 2.2031±0.8128 1.9892±0.72891.2823±0.6134■1.9889±0.6456 1.7202±0.6548 1.0223±0.5834▲0.7039±0.5846■◆地塞米松組72.2019±0.8089 1.9801±0.7376 1.1871±0.69320.7298±0.5494■◆

2.2各組大鼠腦組織梗死灶比較見(jiàn)圖1。假手術(shù)組腦片均紅染，未見(jiàn)白色梗死灶形成；模型24 h組可見(jiàn)尾殼核和額顳頂葉皮層白色梗死灶的融合；地塞米松24 h組及芹菜素24 h組的梗死灶較相應(yīng)時(shí)間的模型組均有不同程度的減小，主要表現(xiàn)在皮層。

圖1　各組腦組織切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色圖

2.3各組腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織TGF-β1的表達(dá)見(jiàn)表2。正常腦組織TGF-β1呈極低表達(dá)。模型組、芹菜素組和地塞米松組各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組、芹菜素組、地塞米松組TGF-β1表達(dá)在24 h、72 h時(shí)達(dá)高峰（P＜0.01），各組24 h和72 h組之間比較無(wú)明顯差異，7 d仍有大量表達(dá)。芹菜素組和地塞米松組較同期模型組表達(dá)均有明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。芹菜素組和地塞米松組相對(duì)應(yīng)時(shí)間組之間表達(dá)量無(wú)明顯差異。

表2　芹菜素和地塞米松對(duì)大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1表達(dá)的影響（OD值，±s）

表2　芹菜素和地塞米松對(duì)大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1表達(dá)的影響（OD值，±s）

與假手術(shù)組比較，★P＜0.01。

組別n模型組6芹菜素組6再灌注6h再灌注24h再灌注72h再灌注7d 0.2728±0.0325★0.3761±0.0327★0.3570±0.0242★◆◆0.3269±0.0243★0.3098±0.0181★▲▲0.4444±0.0206★▲▲0.4256±0.0175★▲▲0.3581±0.0181★▲▲地塞米松組60.3292±0.0170★▲▲0.4326±0.0161★▲▲0.4211±0.0277★▲▲0.3551±0.0224★▲假手術(shù)組60.1287±0.0223

3　討論

本研究結(jié)構(gòu)顯示，腦缺血再灌注時(shí)大鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分異常，但隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)。芹菜素組和地塞米松組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與模型組比較各時(shí)間點(diǎn)均有下降的趨勢(shì)，其中芹菜素組72 h較同時(shí)間點(diǎn)各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者多普遍采用的TTC作為梗死區(qū)域的檢測(cè)標(biāo)記［8］，其具有快速、靈敏、可靠、直觀等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組均出現(xiàn)白色梗死灶，且腦梗死體積有自然縮小的趨勢(shì)。芹菜素組在各時(shí)間點(diǎn)梗死體積均較模型組有減小，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］相符。地塞米松組在各時(shí)間點(diǎn)梗死體積均較模型組有減小，亦與Bertorelli等［10］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

缺血性腦損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后有多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和各種生長(zhǎng)因子的表達(dá)［11］，而缺血周圍區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸則受到多種因素的影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)、少突膠質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生TGF-β1。TGF-β1是一類具有復(fù)雜功能的細(xì)胞因子，作用涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化，參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，體內(nèi)很多正常組織或細(xì)胞都能合成釋放這種因子［12］，可抑制神經(jīng)元的變性和凋亡［13］，修復(fù)受損的腦組織［14］。TGF-β1具有多種生物學(xué)效應(yīng)，參與體內(nèi)多種病理和生理過(guò)程，如免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和活化、腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、血管的發(fā)生、超氧離子的產(chǎn)生等［15］。TGF-β1能通過(guò)調(diào)節(jié)纖連蛋白的合成促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的增殖［16］，也能通過(guò)參與調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子受體基因的活化而影響軟骨細(xì)胞的形成［17］，亦能參與調(diào)控軸突的生長(zhǎng)［3］和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化［18］。在缺血性腦損傷中，TGF-β1有抗氧化、阻止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)生理反應(yīng)、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的多種作用，它可通過(guò)抑制缺血早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而減輕腦水腫、減小梗死面積、促進(jìn)微血管增生［2］，對(duì)組織的修復(fù)發(fā)揮重要作用。

圖2　各組缺血側(cè)皮層TGF-β1胞漿陽(yáng)性表達(dá)（DAB，400倍）

芹菜素組和地塞米松組各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)較同期模型組表達(dá)均有增加，以24 h、72 h組表達(dá)增加最為明顯（P＜0.01），7 d仍有大量表達(dá)。芹菜素組與地塞米松組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芹菜素是一種黃酮類化合物，能抑制大鼠腦缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應(yīng)，降低腦毛細(xì)血管通透性和腦水腫，能通過(guò)TGF-β參與調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長(zhǎng)［19］。

綜上，腦缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)行為功能的改變伴有不同程度的腦梗死，TGF-β1在再灌注后表達(dá)明顯增加，而芹菜素在一定程度上改善大鼠神經(jīng)功能的缺損，并能增強(qiáng)腦缺血后TGF-β1表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)，達(dá)到神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。

［1］Jickling GC，Liu D，Stamova，et al.Hemorrhagic transformation after ischemic stroke in animals and humans［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2014，34（2）：185-199.

［2］Wang Y，Hu Z，Lu W.A modulator for Golgi structural stability after cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.See comment in PubMed Commons belowNeural Regen Res，2013，58（25）：1673-5374.

［3］Bain JM，Ziegler A，Yang Z，et al.TGF beta1stimulates the over-production of white matter astrocytes from precursors othe brain marrow in a rodent model of neonatal encephalopathy［J］.PLoS One，2010，5（3）：9567.

［4］朱榮鑫，張賽龍，金永生.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（1）：5-10.

［5］韓書(shū)珍，范海玲，陳翔.芹菜素對(duì)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠半暗區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.中草藥，2011，42（2）：312-317.

［6］Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture：Neurological and pathological evaluation of an improved model［J］.Stroke，1996，27：1616-1623.

［7］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［8］Goldust EJ，Paczynski RP，He YY，et al.Automated measurement of infact size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains［J］.Stroke，1996，27：1657-1662.

［9］劉嬋，涂豐霞，陳翔.芹菜素對(duì)大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2009，40（10）：1598-1602.

［10］Bertorelli R，Aslarm M，Di Santo E，et al.MK801 and dexamethasone reduce both tumor necrosia factor levels and infarct volume after focal cerebral ischema in the brain［J］.Neurosci Lett，1998，246（1）：41-44.

［11］Berti R，Williams AJ，Moffett JR，et al.Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（9）：1068-1079.

［12］Raineteau，Schwab ME.Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury［J］.Nat Rev Neurosci，2001，（2）：263-273.

［13］李良勇，李家林，謝成娟，等.經(jīng)鼻給予TGFβ1對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（2）：109-112.

［14］Ma M，Ma Y.Intranasal delivery of transforming growth factor-beta1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone［J］.BMC Neurosci，2008，9（10）：117.

［15］Vivien D，Ali C.Transforming growth factor-beta signalling in brain disorders［J］.Cytokine&Growth Factor Reviews，2006，17（1-2）：121-128.

［16］Kim Y，H J，Ryu M，et al.Fibronectin synthesis by high glucose level mediated proliferation of mouse embryonic stem cells：Involvement of ANGⅡand TGF-betal［J］.J Cell Physiol，2010，223（2）：397-407.

［17］Takeda H，Inoue H.Activation of epidermal growth factor receptor gene is involved in transforming growth factor-betamediated fibronectin expression in a chondrocyte progenitor cell line［J］.Int J Mol Med，2010，25（4）：593-600.

［18］Sun J，Zhou W.Ischemia induced neural stem cell proliferation and differentiation in neonatal rat involved vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-beta pathways［J］.Brain Dev，2010，32（3）：191-200.

［19］HuhS，LeeJ.Acell-basedsystemforscreeninghairgrowth-promotingagents［J］.ArchDermatolRes，2009，301（5）：381-385.

Effects of Apigenin on the Expression of Transforming Growth Factor-β1after Cerebral Ischemia-reper-fusion in Rats

WANG Guo，CHEN Xiang.Hangzhou First People′s Hospital，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310000，China

Objective：To investigate the effects of apigenin（APG）on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）of focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods：Cerebral ischemia was induced by middle cerebra artery occlusion.The rats were randomly divided into four groups including Sham-operated，Mode，APG and Dexamethasone groups.All the operated groups were divided into different groups：reperfusion 6 h group，24 h group，72 h group and 7 d group.Neurological behavior was assessed with five score methods.After anesthesia awake，each group was given neurological behavior scores.One brain slice was observed by 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）stainning，and the expression of TGF-β1in another six brain slices were measured by immunohi stochemistry.Results：Neurological behavior scores of the rats in A72 h group was significant lower than those in ischemia M72 h group（P＜0.05）.Typical cortical infarct lesions in Mode group were found by TTC stainning.The expression of transforming growth factor-β1in normal brain tissue was in very low volume.The expression of transforming growth factor-β1were enhanced immediately after ischemia，and reached to peak at 24 hour and 72 hour after ischemia respectively，Apigenin could significantly increase the expressions of TGF-β1than ones at the corresponding time points in group M respectively（P＜0.05）.Conclusion：Apigenin can increase the expression of transforming growth factor-β1in transient focal cerebral ischemia and reperfusion in rats.They may repair ischemia brain tissue and improve neurological function recovery by transforming growth factor-β1.

Apigenin（APG）；Cerebral ischemia-reperfusion；2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）；Transforming growth factor-β1（TGF-β1）

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1546-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.015

2015-05-27）

浙江省溫州市科技局國(guó)際合作項(xiàng)目（H20070034）

（電子郵箱：guoguo1109@163.com）