趙永平 沙寧寧 王 越 陳 曦

北京大學人民醫(yī)院計劃生育與生殖醫(yī)學科（北京 100044）

睪丸微石癥所致精子DNA損傷

趙永平 沙寧寧 王 越 陳 曦*

北京大學人民醫(yī)院計劃生育與生殖醫(yī)學科（北京 100044）

目的 研究睪丸微石癥（testicular microlithiasis，TM）患者精液質量及精子DNA損傷程度。方法 TM組：1 346名男性不育患者，采用高頻彩色多普勒超聲檢查雙側睪丸，其中35名確診為TM，平均年齡（23.39±3.36）歲；對照組：23名正常生育力男性，平均年齡（25.28±5.18）歲。所有研究對象均留取精液標本進行精液常規(guī)分析；采用抗活性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）標記精子，使用流式細胞儀檢測精子細胞凋亡率；精子染色質擴散實驗分析精子DNA碎片率；苯胺藍染色法評價精子核成熟度。所有數(shù)據(jù)均進行統(tǒng)計學分析。結果 TM組與對照組的精子細胞凋亡率分別為（0.86±0.25）% vs（0.19±0.12）%，精子核成熟度分別是（56.7±8.5）VS（11.6±3.3），精子DNA碎片率分別為（31.6±4.6）vs（13.3±3.9），以上指標兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。TM組與對照組的精子濃度、精子總活力、前向運動精子比率以及正常形態(tài)率比較差異也均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 TM可能會導致精子質量下降，精子DNA損傷程度增加。

睪丸微石癥； 精子； 細胞凋亡； DNA損傷

TM指彌散分布于睪丸生精小管內、直徑＜3 m m的眾多鈣化灶形成的綜合征，B超檢查可見睪丸實質內多發(fā)性微小鈣化灶［1］。TM病因及發(fā)病機制尚不明確。TM沒有特異性臨床表現(xiàn)，大部分患者在常規(guī)體檢、孕前檢查或存在生育障礙時被發(fā)現(xiàn)。目前，TM患者的生育問題、發(fā)生腫瘤危險引起人們的關注。本研究擬對因男性不育就診的TM患者的患病率、精液質量，以及精子DNA損傷程度進行分析。

臨床資料

一、一般資料

2011年2月至2012年11月在北京大學人民醫(yī)院計劃生育與生殖醫(yī)學中心以不育癥就診的男性患者1 346例，均采用高頻彩色多普勒超聲檢查雙側睪丸、附睪及精索，其中，35名患者（2.6%）發(fā)現(xiàn)彌散分布于睪丸生精小管內、直徑＜3 mm的多發(fā)性鈣化灶，確診為TM（圖1）。這35名患者作為TM組，年齡23～36歲（23.39±3.36）歲；雙側睪丸總容積為（25±3.11）mL，質地中等，均未觸及明顯結節(jié)或包塊。其中，雙側TM31例，單側4例。對照組為正常生育能力的男性自愿者23例，年齡24～40歲（32.28±5.56）歲。所有研究對象均接受詳細體檢及實驗室檢測，并簽署知情同意書。

圖1 彩色多普勒超聲示TM彌散分布于睪丸實質內、直徑＜3mm的多發(fā)性鈣化灶

二、排除標準

（1）精索靜脈曲張；（2）睪丸或附睪炎；（3）男性性腺功能異常；（4）遺傳因素；（5）有嚴重的影響精液質量的不良嗜好（包括長期酗酒、頻繁蒸桑拿等）；（6）使用損害精液質量的藥物；（7）慢性前列腺炎；（8）無精子癥。

三、研究方法

（一）男科檢查

所有研究對象均進行詳細的男科調查，填寫現(xiàn)病史、家族史和婚育史。禁欲2～7d ，手淫法留取精液標本。盛于干燥無菌無毒的取精杯內，放置于37℃水浴恒溫箱。每位研究對象3周內再次留取一份完整標本。

（二）精液分析與標本冷凍保存

按《WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊（第5版）》要求［2］，使用CASA至少檢測兩次以上精液質量。所有檢測結果均進行質量控制。精液標本加入冷凍保護劑（1:1）混合，逐步降溫后置于液氮保存。

（三）精子細胞凋亡檢測

采用PE Active Caspase-3 Apoptosis kit（BD-550914）分析精子細胞凋亡，冷凍精液標本，置于37℃水浴中孵育30min，解凍復蘇。吸取解凍的精液樣本各100μL，加入冷的PBS緩沖液混勻后，500×g，離心5min洗滌細胞兩次，再用Cytofix/Cytoperm Solution緩沖液調整細胞濃度為1×106/0.5mL，充分混勻。細胞冰浴20min。細胞離心，棄上清。使用perm/Wash Buffer緩沖液洗細胞兩次，每個測試樣本加入100μL perm/Wash Buffer緩沖液混懸精子，標記組加入20μL抗活性Caspase-3抗體，空白對照組加入等體積緩沖液。按樣本數(shù)加入perm/Wash Buffer緩沖液和抗體，室溫反應30min。用1.0mL的perm/Wash Buffer緩沖液洗細胞一次，再用0.5mL的perm/Wash Buffer緩沖液制成細胞懸液，在流式細胞儀（FACSCalibur 美國 Becton Dicknson公司）上進行樣本分析。

（四）精子染色質擴散實驗分析精子DNA碎片率

使用精子DNA碎片檢測試劑盒（深圳博瑞德生物公司，產(chǎn)品編號：20102400795），按照試劑盒指示進行操作。取稀釋后的精液標本0.3mL，加入0.7mL瓊脂凝膠混勻，37℃孵育；吸取50μL上述精子混合液滴在瓊脂預處理過的載玻片上，蓋上22mm×22mm 蓋玻片4℃置5min。精子變性及裂解，室溫將標本載玻片浸入鹽酸內變性7min，精子裂解液內20min；緩沖液中3min，脫水。將標本載玻片依次放人70%、90%和100% 的乙醇中脫水?？諝飧稍锖蠹尤?，6-二脒基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡下觀察精子頭部光暈狀態(tài)，計數(shù)200個精子中小光暈、無光暈、正常光暈的比率。

（五）苯胺藍染色法評價精子核成熟度

使用精子核蛋白組型轉換半定量檢測試劑盒（深圳華康生物醫(yī)學公司，產(chǎn)品編號：220101020），按照試劑盒說明書進行操作。調整精子濃度至40×106/mL，取lmL標本，1 000 rpm×3min，去上清液，重復3次，加入lmL粘合液后涂片，空氣干燥，加固定液固定90s，脫色、封片、苯胺藍染色，顯微鏡觀察。顯藍色的為陽性，不顯色的為陰性，每個標本計數(shù)200個精子。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件，進行t 檢驗。

結 果

一、TM組與正常對照組精液質量檢測結果

TM組與正常對照組各精液參數(shù)結果如表1所示，TM組患者精液各項參數(shù)顯著下降（P＜0.05）。

二、TM組與正常對照組精子DNA損傷程度分析結果

采用PE標記的抗活性Caspase-3抗體對精子進行標記后，流式細胞技術檢測精子細胞凋亡，精子抗活性caspase-3標記陽性率平均為（0.86±0.25）%。統(tǒng)計學分析顯示，TM組與對照組兩組間比較，精子細胞凋亡率、精子核成熟度及精子DNA碎片率均具有顯著性差異（P＜0.01）。見表2，圖1，圖2。

表1 兩組精液參數(shù)及精子細胞凋亡檢測結果比較

表2 兩組精子細胞凋亡率、核成熟度及精子DNA碎片率分析結果（s）

表2 兩組精子細胞凋亡率、核成熟度及精子DNA碎片率分析結果（s）

*: 兩組均數(shù)比較P＜0.01； **: 兩組均數(shù)比較P＜0.05

例數(shù)（n） 細胞凋亡率（%） 核成熟度（%） 小光暈（%） 無光暈（%） 正常光暈（%） DNA碎片率（%）TM組 35 0.86±0.25 56.7±8.5 12.2±3.1 18.8±3.5 67.1±7.3 31.6±4.6對照組 23 0.19±0.12** 11.6±3.3* 6.7±2.7** 6.3±3.1** 85.9±4.5 ** 13.3±3.9* t值 8.31 2.75 2.15 2.22 2.36 3.28 P值 0.00 0.007 0.033 0.022 0.02 0.001

圖2 熒光顯微鏡下觀察兩組精子頭部光暈狀態(tài)（×400）A: 對照組，正常光暈精子多見； B: TM組，無光暈及小光暈精子多見

討 論

TM是指睪丸內多發(fā)鈣化灶為特征的一種臨床綜合征。臨床上常認為TM是一種比較少見的男性生殖系統(tǒng)良性疾病。近期研究發(fā)現(xiàn)［3-6］，TM患者不僅存在生育力低下，TM還可能與睪丸惡性腫瘤發(fā)生有一定的關系，因此，建議泌尿男科醫(yī)生要重視TM。

TM發(fā)病率低，無明顯臨床癥狀，容易被忽視。大多數(shù)患者因精液質量低下、生育障礙或常規(guī)體檢時被發(fā)現(xiàn)。彩色多普勒超聲檢查使TM的檢出率逐年上升［7，8］。Mazzilli［9］報告，TM的患病率達4.6%。本組35例TM患者，占總研究對象的2.6%，都是由于不孕不育問題進行精液檢查發(fā)現(xiàn)精液質量差，采用高頻彩色多普勒超聲檢查時發(fā)現(xiàn)TM。超色多普勒超聲可以作為TM診斷的金標準。TM的超聲圖像診斷標準為：（1）同1個B超切面圖像有5個或5個以上的微小鈣化灶；（2）鈣化灶直徑為＜3 mm；（3）彌漫性分布于睪丸實質內；（4）多為雙側性對稱分布；（5）鈣化灶不伴聲影；（6）睪丸的形態(tài)及容積正?；蜃冃　ushby等［10］分析睪丸內外鈣化灶可能是睪丸內靜脈結石、精原性肉芽腫、血管壁鈣化或睪丸腫瘤。睪丸靜脈結石、精原性肉芽腫或血管壁鈣化多為孤立的點狀強回聲，后方可有聲影，少數(shù)可成簇狀排列，但數(shù)目較TM少，局限于睪丸某個部位。睪丸內團塊狀強回聲病灶可以發(fā)生在睪丸腫瘤、慢性梗阻性病變、睪丸炎、肉瘤樣病、肉芽腫或為瘢痕組織，這些團塊狀強回聲可為圓形、橢圓形或不規(guī)則形。臨床上基本可以借助這些影像學特征進行鑒別診斷。

目前，認為TM的病因與男性生殖系統(tǒng)其他疾病密切相關［6-8］。臨床報道表明，TM與男性不育、睪丸炎、睪丸鞘膜積液、精索靜脈曲張、睪丸發(fā)育不良、隱睪等伴隨發(fā)生。近期文獻報道，隨診過程中發(fā)現(xiàn)一些TM患者發(fā)生睪丸腫瘤。TM與這些生殖系統(tǒng)疾病到底是因果關系，還是共存關系，尚需要進一步探討。TM的形成可能是由于睪丸內具有吞噬功能的足細胞吞噬功能喪失，導致生精小管管壁變性、壞死、脫落的生精細胞堆積，繼而鈣鹽沉積形成微小的鈣化灶。睪丸活檢病理學分析顯示，TM患者睪丸生精小管內形成分化不良的鈣化片，提示與睪丸組織的萎縮和變性有關；微小的鈣化灶涉及20%～60%睪丸生精小管，主要成分是羥磷灰石。

多個臨床研究發(fā)現(xiàn)［3-6］，TM患者精液質量低下，一些患者發(fā)生睪丸腫瘤。因此，可以這么認為，TM是睪丸良性病變，但存在發(fā)展睪丸腫瘤的可能性。病理學分析顯示，在睪丸惡性腫瘤的標本中常發(fā)現(xiàn)TM，提示TM可能與睪丸惡性腫瘤有一定的相關性，甚至有學者［4］認為TM可能是一種癌前期病變。Miller等［6］回顧分析了3477名TM及睪丸鈣化灶患者，發(fā)現(xiàn)TM與睪丸原發(fā)性惡性腫瘤發(fā)生有一定關系。盡管臨床上對TM與睪丸腫瘤之間的關系還存在爭議，但是，均建議長期隨訪、定期彩超檢查。本組35例TM患者隨訪2年，未發(fā)現(xiàn)睪丸腫瘤，有待于對長期隨訪結果進一步研究。

有關TM患者精子DNA損傷研究尚未見報道。本研究通過對35名確診為TM患者檢測精子細胞凋亡率、分析精子DNA碎片率和評價精子核成熟度，結果發(fā)現(xiàn)，TM患者除了精子質量低下外，還存在精子細胞凋亡率增加，精子核成熟度異常，精子DNA碎片率明顯升高。結果提示TM可能導致精子DNA損傷程度增加，但其病理生理學機制尚不完全明確。分析認為，精子DNA損傷程度增加可能與TM擠壓、堵塞生精小管，導致生精小管萎縮、生精細胞變性、壞死、脫落，精子形成的微環(huán)境受到破壞等有關。精子DNA損傷可能有3種途徑［11］，一是染色質包裝異常，拓撲異構酶Ⅱ、核蛋白構成及比值異常、魚精蛋白缺陷或功能異常；二是氧化應激（oxidative stress）：精液中的ROS 增加或精漿抗氧化能力下降；三是精子凋亡異常：Caspase啟動途徑，線粒體細胞色素C介導等途徑。TM導致精子DNA損傷程度增加可能是造成不育癥的分子學原因。

由于目前對TM缺乏有效的預防和治療手段，建議對TM患者定期分析精子質量及精子DNA損傷程度；建議TM患者盡早生育，如果存在生育障礙，應實施人工輔助生殖技術或冷凍保存精子。

精子DNA損傷程度增加與TM之間的相關性尚需進一步深入研究。

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（2015-06-18收稿）

Sperm parameters and DNA damage analysis in male patients with testicular microlithiasis

Zhao Yongping， Sha Ningning， Wang Yue， Chen Xi*
Department of Family Planning and Reproductive Medical Centre， Peking University People's Hospital， Beijing 100044， China
Corresponding author: Chen Xi， E-mail: ccemu08@126.com

Objective To investigate the semen quality and the sperm DNA damage in patients with testicular microlithiasis （TM）. Methods Total of1346 patients with male infertility underwent ultrasound examination for the bilateral testicles， and 35 of them were diagnosed as TM， with an average of 23.39±3.36 years old. Twenty-three male patients with normal fertility were recruited as the controls， with an average of 25.28±5.18 years old. All the subjects underwent semen analysis.The sperms were tagged with Caspase-3， and their apoptosis were measured by fi ow cytometry， the sperm DNA fragmentation rate was measured by the sperm chromatin diffusion test. Toluidine blue staining method was used to evaluate the sperm maturity. All the data were analyzed by SPSS software. Results The sperm apoptosis rate were 0.86±0.25% VS 0.19±0.12% in the TM group and the control group， respectively. The sperm maturity rate and DNA fragmentation rate were 56.7±8.5 VS11.6±3.3 and 31.6±4.6 VS13.3±3.9， respectively， with signifi cant difference （P＜0.01）. there were signifi cant differences in the mobility， total viability， progressive motive rate and normal morphology rate between TM group and the control group （P＜0.05）. Conclusion TM may result in a decrease in sperm quality and an increase in sperm DNA damage.

testicular microlithiasis； spermatozoa； apoptosis； DNA damage

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.006

R 698.2

*通訊作者， E-mail: ccemu08@126.com