劉西梅+華再東+李莉+等

摘要：以顯微注射的方法，將去掉原核DNA的PcDNA3.1IGFTREtrTA誘導(dǎo)型IGF-1載體注射到豬受精卵原核中，經(jīng)胚胎移植、懷孕、產(chǎn)仔、取樣、檢測(cè)等過程，得到幼仔85頭，其中的11頭為PCR檢測(cè)陽性，進(jìn)一步的Southern blot 檢測(cè)有10頭陽性，即構(gòu)建的原代誘導(dǎo)型IGF-1轉(zhuǎn)基因豬有10頭。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)型；IGF-1；轉(zhuǎn)基因豬

中圖分類號(hào)：S828.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-5077-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.038

Transgenic Pig Construction of the Inducible IGF-1 Model

LIU Xi-mei， HUA Zai-dong， LI Li， ZHANG Li-ping， XIAO Hong-wei， REN Hong-yan， BI Yan-zhen

（Hubei Academy of Agriculture Science/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract：In this study， the pcDNA3.1IGFTREtrTA induced IGF-1 vector without prokaryotic DNA was microinjected into pronucleus of pig fertilized eggs. Through embryo transfer， pregnancy， parturition， sampling and testing procedures， 85 little life born， of which 11 was tested positive for PCR， 10 positive for Southern blot detection. It indicated that there had 10 primary transgenic pigs of inducible IGF-1 in the test.

Key words：inducible； IGF-1； transgenic pig

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物遺傳育種能大大加快遺傳改良的進(jìn)展，具有傳統(tǒng)遺傳育種所不具有的優(yōu)勢(shì)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)步，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的外源基因的不可調(diào)控性正逐漸被克服。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因使轉(zhuǎn)基因技術(shù)有了革新性的發(fā)展，使人們有了一個(gè)更靈活的對(duì)遺傳時(shí)空調(diào)控的開關(guān)，可以幫助人們弄清楚基因在疾病或發(fā)育過程中的作用、發(fā)揮作用的關(guān)鍵時(shí)期以及其他精確的信息。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因作為一個(gè)理想的遺傳開關(guān)應(yīng)該具備以下幾個(gè)條件：①當(dāng)其關(guān)閉時(shí)，本底表達(dá)為零，當(dāng)其打開時(shí)應(yīng)能使轉(zhuǎn)基因高表達(dá)；②這個(gè)開關(guān)是可逆的，在發(fā)育或出生后的任何時(shí)間，能快速而且可逆地控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)；③對(duì)其所控制的靶基因是特異的；④不被細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)所干擾；⑤不影響細(xì)胞內(nèi)的基本代謝反應(yīng)。條件轉(zhuǎn)基因體系的出現(xiàn)對(duì)于研究基因功能以及動(dòng)物模型發(fā)育期間基因表達(dá)的分析有著重大的意義[1]。近年來人工合成的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用較為廣泛，這些基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在組成和結(jié)構(gòu)上有所不同，但基本都包括三個(gè)組成部分，即調(diào)控部分、攜帶目的基因的反應(yīng)部分和誘導(dǎo)因子部分，目標(biāo)是在細(xì)胞或動(dòng)物整體水平實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控，其中Gossen等[2，3]建立的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)即Tet—off/Tet—on系統(tǒng)是較完善的最具代表性的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)之一，目前已成功地用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究[4]。胰島素樣生長因子1（IGF-1）是動(dòng)物生長發(fā)育的重要因子之一。不同品種和不同性別豬發(fā)育過程中血液的IGF-I水平變化趨勢(shì)基本一致，即胚胎期低，出生后高。胚胎期隨胚齡的增加，IGF-I水平升高。出生后隨年齡、體重的增加，IGF-I水平也上升，但不同性別和品種豬血液中IGF-I水平還是有很大差別的。胎兒期，瘦肉型豬肝臟中IGF-I水平高于脂肪型豬。研究發(fā)現(xiàn)，出生第一天血液中IGF-I水平瘦肉型豬高于脂肪型豬，3～5月齡的IGF-I上升幅度瘦肉型豬也高于脂肪型豬。對(duì)性別差異的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠 94～98 d雄性胎兒的IGF-I水平高于雌性，出生后差異仍然存在，在3～18月齡雄性豬血液中IGF-I水平要比雌性升高得快。對(duì)大白豬的研究也發(fā)現(xiàn)，45日齡后大白豬母豬的 IGF-I水平比大白豬公豬低[5-7]。本試驗(yàn)通過構(gòu)建誘導(dǎo)型IGF-1轉(zhuǎn)基因豬，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高IGF-1的表達(dá)，為進(jìn)一步探索IGF-1在提高生產(chǎn)性能方面的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 誘導(dǎo)型豬IGF-1基因 動(dòng)物胚胎及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存[8.9]，結(jié)構(gòu)見圖1。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 湖北白豬11～12月齡的后備母豬。

1.1.3 試劑藥品 HCG、PMSG，寧波激素二廠；青霉素、鏈霉素、麻藥（氯胺酮、戊巴比妥鈉）、磺胺粉等購于湖北省醫(yī)藥公司；地高辛試劑盒，羅氏公司；其他試劑均來源于GIBC公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫 試驗(yàn)豬按照后備豬免疫程序進(jìn)行免疫。

1.2.2 超排 在發(fā)情前4～5 d，按1 000 IU/頭注射PMSG；發(fā)情前1 d，按1 000 IU/頭注射HCG[10]。

1.2.3 配種 觀察到開始發(fā)情時(shí)計(jì)，推遲半天進(jìn)行配種，本交或人工授精均可，每隔8～12 h配一次，共配3次。

1.2.4 手術(shù)收集胚胎 用戊巴比妥鈉按20～30 mg/kg體重麻醉試驗(yàn)豬，仰臥保定，手術(shù)部位為沿腹中線倒數(shù)第2、3個(gè)乳頭之間，清理、消毒創(chuàng)部，盡量避開血管，沿腹中線切開皮膚5～8 cm，分離脂肪、肌肉、腹膜層，輕輕牽出輸卵管，在輸卵管傘部一側(cè)插入一根直徑約3 mm的引導(dǎo)收集管，用大拇指和食指固定，游離端接表面皿，在宮管結(jié)合部將針頭朝輸卵管方向插入，用注射器快速注入37 ℃ PBS液，PBS液沿宮管結(jié)合部經(jīng)輸卵管攜帶著胚胎流至表面皿，胚胎懸浮于PBS液體中。再換另一側(cè)輸卵管同樣操作沖出胚胎。在實(shí)體顯微鏡下，分揀正常發(fā)育的1～2級(jí)細(xì)胞胚胎（卵）備用[10]。endprint

1.2.5 胚胎離心及顯微注射 用移卵管將正常的卵移入1.5 mL透明的離心管內(nèi)，以15 000 r/min離心3～5 min。離心時(shí)間依據(jù)卵的實(shí)際情況而定。先在凹玻片的中央滴一滴20～30 μL PBS液，覆以石蠟油，然后將離心后的受精卵5～6枚移至液滴中，置于倒置顯微鏡下，每個(gè)細(xì)胞核注入DNA的劑量約2 PL（約含300～600個(gè)基因拷貝）。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因胚胎移植 受體按供體的手術(shù)方法，麻醉、保定、切口，引出輸卵管，將吸有胚胎的移卵管（采用三段式，即氣泡-胚胎-氣泡）從輸卵管傘口插入輸卵管至壺腹部，然后把移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液吹入輸卵管內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管退出，復(fù)原輸卵管傘。移卵之后的移卵管吸取PBS，置于實(shí)體顯微鏡下，檢查有無余卵。若發(fā)現(xiàn)有未移入卵，要重復(fù)上述步驟，移到另外一側(cè)輸卵管。確信管內(nèi)無余卵后，即可將卵巢 、輸卵管或子宮角清洗，送入腹腔，縫合術(shù)部，創(chuàng)口內(nèi)撒磺胺，外涂碘酊，腹腔注射抗生素。觀察受體懷孕情況，等待產(chǎn)仔[11]。

1.2.7 取樣檢測(cè) 受體懷孕足月產(chǎn)仔，在給幼仔剪耳號(hào)的同時(shí)，收集耳組織樣，用DNA提取試劑盒提取DNA。PCR檢測(cè)引物F：5′-CCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATAT-3′，R：5′-CGATAAGCCA

GTAAGCAGTGGGTTC-3′。反應(yīng)體系為：樣品模板DNA 5μL，10 ×Buffer （含15 mmol/L MgCl2） 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 3 μL，10 μmol/L F1 2 μL，10 μmol/L R1 2μL，Taq DNA 聚合酶1 μL（1 U/μL），加去離子水至25 μL 。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃變性3 min ；94 ℃變性55 s ，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Southern檢測(cè)探針為跨IGF1-TRE-rtTA載體上的一段2.0 kb DNA片段，按地高辛檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行Southern檢測(cè)操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因胚胎移植及產(chǎn)仔

此次試驗(yàn)共移植受體母豬26頭，移入顯微注射胚514枚，其中一細(xì)胞期胚胎426枚，占82.7%。16頭受體產(chǎn)仔，受胎產(chǎn)仔率61.5%（16/26）；共產(chǎn)仔85頭，懷孕受體頭均產(chǎn)仔數(shù)5.3頭。其中活仔78頭（♂43頭，♀35頭），活仔率91.8%（78/85）；死胎7頭，死胎率8.2%。這一轉(zhuǎn)基因胚胎移植效率及產(chǎn)仔數(shù)與魏慶信等[12]的結(jié)果相似，說明誘導(dǎo)型IGF-1基因?qū)ε咛ゼ疤喊l(fā)育影響不明顯，即受胎產(chǎn)仔率、產(chǎn)仔數(shù)、活仔率、死胎率等與相關(guān)報(bào)道結(jié)果基本一致[11.13]。

2.2 PCR檢測(cè)仔豬

受體產(chǎn)下的小豬，取剪耳號(hào)的組織塊少許（100 mg），提取組織DNA，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，用1%瓊脂糖凝膠、1×TAE 緩沖液、75 V 電壓電泳40 min ，在紫外燈下觀察擴(kuò)增情況。每個(gè)樣品重復(fù)3 次PCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，在紫外燈下觀察到一條1.3 kb目的擴(kuò)增片段的樣品即為轉(zhuǎn)pcDNA3.1-IGF1-TRE-rtTA基因陽性豬。在85頭仔豬樣品中，有11頭樣品得到與陽性對(duì)照一樣大小的電泳帶（圖2），確定為PCR陽性豬。

2.3 Southern檢測(cè)

對(duì)PCR陽性樣品做進(jìn)一步檢查，即Southern雜交，結(jié)果除7號(hào)樣品沒有顯示與陽性對(duì)照大小一致的雜交帶外，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11樣品均有雜交帶（圖3），表明有10個(gè)樣品帶有誘導(dǎo)型IGF-1基因，它們對(duì)應(yīng)的仔豬編號(hào)見表1，即有10頭轉(zhuǎn)誘導(dǎo)型IGF-1基因仔豬。兩種檢測(cè)結(jié)果完全相符，確認(rèn)表1所列10頭豬為陽性的轉(zhuǎn)IGF-1基因豬。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)基因方法

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法比較多，包括顯微注射法、病毒感染法、精子載體法、電轉(zhuǎn)法、脂質(zhì)體法、體細(xì)胞克隆法等，其中顯微注射法是一種傳統(tǒng)的、穩(wěn)定的體系，最為關(guān)鍵的是它能做到制備無標(biāo)記、穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物，尤其是當(dāng)今的基因編輯技術(shù)，利用顯微注射可以實(shí)現(xiàn)基因組編輯，而且不帶任何標(biāo)記，其他方法要生產(chǎn)既無標(biāo)記又能穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物就特別困難[11，14]，本試驗(yàn)用顯微注射制備誘導(dǎo)型IGF-1轉(zhuǎn)基因豬過程中，載體上去掉了原核骨架，僅保留有效的表達(dá)結(jié)構(gòu)部分重組DNA，這一誘導(dǎo)型結(jié)構(gòu)在需要表達(dá)的階段，飼以誘導(dǎo)劑（四環(huán)素或強(qiáng)力霉素），促進(jìn)表達(dá)，改變豬的生產(chǎn)性能，這種豬的構(gòu)建為進(jìn)一步育種工作奠定了基礎(chǔ)。

3.2 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，為了簡化檢測(cè)程序，在對(duì)目的基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)時(shí)，常常采用可以直觀分辨轉(zhuǎn)基因個(gè)體的元素，常用的有毛色、膚色、發(fā)光、藥物刺激表象、動(dòng)作特征等。如能夠表達(dá)黑色標(biāo)記的個(gè)體，在白色群體中黑色個(gè)體為陽性轉(zhuǎn)基因豬；帶有熒光（GFP、RFP等）標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，在激發(fā)光刺激下會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光等；而藥物刺激表象、動(dòng)作特征類型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物僅有轉(zhuǎn)基因鼠個(gè)體出世[15]。這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)比較容易，不需要試劑、藥品和專門的儀器設(shè)備，仔豬一出生就能很快鑒別，但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，需要設(shè)計(jì)特別的標(biāo)記基因。而本試驗(yàn)考慮到將來IGF-1轉(zhuǎn)基因豬育種問題，不宜帶特別的標(biāo)記基因，這就需要做分子生物學(xué)檢測(cè)—PCR及Southern檢測(cè)，其中PCR檢測(cè)快速、敏感，但易受采樣、試驗(yàn)環(huán)境、操作過程等因素的影響而導(dǎo)致假陽性，因此，每個(gè)樣品要重復(fù)多次，即便是這樣還是不能保證陽性的正確性，只有做進(jìn)一步的Southern檢測(cè)。Southern檢測(cè)過程復(fù)雜，敏感性低，正確性高，一般重復(fù)一次即可，而且重復(fù)性比較好。不過對(duì)原代轉(zhuǎn)基因豬而言，用基因組DNA檢測(cè)很容易漏檢，所以改用PCR樣品的Southern檢測(cè)，獲得整合目的基因的IGF-1轉(zhuǎn)基因。就誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因豬檢測(cè)還可以考慮結(jié)構(gòu)基因中不同片段的檢測(cè)，以便從不同的角度進(jìn)行檢測(cè)，作為進(jìn)一步的佐證來提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[9.16]。endprint

3.3 轉(zhuǎn)基因效率

應(yīng)用原核注射法制備轉(zhuǎn)基因豬的效率在0.31%～4.00%之間，平均效率為1.10%。在同一實(shí)驗(yàn)室的趨勢(shì)是后期的效率比前期的高。這不難理解，前期還處于摸索技術(shù)、建立方法的過程中，而后期技術(shù)趨于成熟、諸多環(huán)節(jié)得到改進(jìn)、操作逐漸熟練、效率也隨之逐步提高。國內(nèi)有部分轉(zhuǎn)基因豬試驗(yàn)平均效率達(dá)到2.4%，這與自體移植技術(shù)的應(yīng)用不無關(guān)系[11]。除技術(shù)層面之外，轉(zhuǎn)基因的效率還與外源基因有關(guān)，如外源基因過表達(dá)、目的基因表達(dá)產(chǎn)物有毒副作用（致胚胎、胎兒死亡或畸形等）、外源基因整合位點(diǎn)效應(yīng)等都會(huì)影響轉(zhuǎn)基因效率[12]。

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