高飛云 李充璧

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)蒙呼和浩特 010110; 2.肇慶學(xué)院 廣東肇慶 526061)

葛花是豆科植物野葛[Pueraria Lobata(Willd)Ohwi]的干燥花蕾,葛花在歷代本草中均有記載,其主要用于解酒醒脾,其余療效較為廣泛,如:抗腫瘤、降糖、護肝等功效,是中藥中具有標(biāo)志性的解酒藥。起主要有效成分為黃酮類化合物[1-3]。本實驗是通過葛花提取物對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的作用,提示葛花提取物對此類損傷具有的保護和預(yù)防的作用。酒精性肝病(alcoholicliver disease,ALD)是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病,初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,進而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化,嚴重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細胞壞死甚或肝功能衰竭。至今臨床上還沒有有效防治其發(fā)生發(fā)展的理想藥物。本試驗旨在觀察葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器 臺式多功能凍干機(heto power dry LL3000);RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); Waters高效液相色譜系統(tǒng)(含Waters 1525泵,Waters 2487雙通道紫外檢測器,Waters 717plus自動進樣器, Breeze色譜工作站,美國Waters公司);

3-1 小鼠ALT測定結(jié)果

主要試劑 葛花(肇慶學(xué)院自購);冰醋酸、石油醚、乙酸乙酯、鄰苯三酚、甲醇、乙醇等均為分析純,購置于廣州化學(xué)試劑廠;ALT/AST試劑盒,購自上海生物工程科技有限公司。

1.2 實驗方法

葛花提取物的制備 稱取葛花10克,準(zhǔn)確稱取100ml 70%的乙醇,浸泡1小時后,連續(xù)回流3次,每次均有70%的乙醇100ml,每次提取1h,收集3次的濾液,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇,冷凍干燥。

1.3 小鼠急性酒精肝模型的制備

方法參照周瓊在《小鼠急性肝損傷模型的建立及GSTA1分析》中提到的乙醇至小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制。

小鼠在隔夜禁食后,以15ml/ml的劑量灌胃56度紅星二鍋頭,每日灌胃一次,連續(xù)7d。末次染毒后處死小鼠,檢測肝功能指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)肝功能損傷,并出現(xiàn)肝臟細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的治療作用

1.4.1 取制作好的小鼠急性酒精肝模型90只,隨機分為3組。分別為1組對照組、2組治療組、3組空白組。

1.4.2 1組對照組每天以0.02g/kg的劑量灌胃三也真品舒肝片,每天2次。2組治療組以0.005g/kg的劑量灌胃葛花提取物,每天次。3組空白組灌胃同樣劑量的生理鹽水,每天2次。其他實驗條件保持一致。

1.4.3 連續(xù)灌胃一周后,末次灌胃后8小時處死小鼠,取小鼠肝臟,研磨勻漿后,利用ALT/AST試劑盒測試小鼠的ALT/AST指標(biāo),并與空白組及對照組做對比。

1.5 葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的預(yù)防作用

1.5.1 取正常小鼠90只,隨機分為3組。分別為1組對照組、2組治療組、3組空白組。

1.5.2 1組對照組每天以0.02g/kg的劑量灌胃三也真品舒肝片,每天2次。2組治療組以0.005g/kg的劑量灌胃葛花提取物,每天次。3組空白組灌胃同樣劑量的生理鹽水,每天2次。其他實驗條件保持一致。

1.5.3 連續(xù)灌胃一周后,采用小鼠急性酒精肝模型的制備方法,以15ml/ml的劑量灌胃56度紅星二鍋頭,每日灌胃一次,連續(xù)7d。末次染毒后處死小鼠,取小鼠肝臟,研磨勻漿后,利用ALT/AST試劑盒測試小鼠的ALT/AST指標(biāo),并與空白組及對照組做對比。

2 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理,實驗所得數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± S)表示,顯著性檢驗采用T檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1.葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的治療作用

提示葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有治療作用,在小鼠ALT/AST指標(biāo)的測定中,治療組與對照組及空白組比較,P值均<0.05,具有統(tǒng)計學(xué)意義。故認為葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有效。

與空白相比,*P<0·05,**P<0·01,對照組與治療組均有效

討論:

ALD發(fā)病機制可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒理作用、氧應(yīng)激、免疫誘導(dǎo)和細胞因子、細胞凋亡、遺傳、病毒的疊加作用等有關(guān)[4]。對于葛花的研究,其藥理作用研究的非常之多,而對于急性酒精性肝損傷,研究也相對較多?，F(xiàn)在已經(jīng)有較多的針對急性酒精性肝損傷治療和預(yù)防的藥物問世,像柴胡、咖啡因等。但迄今為止,臨床上還沒有有效防止急性酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展的有效藥物。近年來,有許多研究提示飲用咖啡因(caffeine)為基礎(chǔ)的飲料可以減少肝臟患病的幾率,尤其對嗜酒者效果更加明顯[5-6]。也有學(xué)者指出梔子京尼平苷對小鼠急性酒精性肝損傷有保護作用[7]。中醫(yī)本草記載葛花有護肝作用,但葛花對急性酒精性肝損傷的效果還研究較淺。血清的ALT和AST是反映肝細胞受損的重要指標(biāo),在葛花提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn),ALT的變化是較為明顯的,AST的變化不是很明顯。由此可以說明,姜黃素對小鼠肝臟的保護是有局限性的。如果搭配其他藥物,效果應(yīng)該會進一步提升。

[1]尹俊亭,仲英,孫敬勇,等. 葛花的研究進展[J]．中草藥,2005,36(12):1905-1906.

[2]Shin J E,Bae E A,Lee Y C,et al. Estrogenic effect of main compo－nents kakkalide and tectoridin of Puerariae Flos and their metabo－lites[J]. Biol Pharm Bull, 2006,29(6):1202-1206.

[3]Lee M K,Cho S Y,Jang J Y,et al. Effects of puerariae flos and puer－ariae radix extracts on antioxidant enzymes in ethanol-treated rats[J]. Am J Chin Med,2001,29(2):343-354.