陳歆++龔晶晶++彭黎旭

摘 要 莽草酸是抗禽流感特效藥達菲的主要原料。本文以天然植物八角茴香（Illicium verum）為原料，使用高效液相色譜儀，采用單因素試驗方法，分別以水、乙醇及甲醇為提取液，探討從八角茴香中提取莽草酸的效率。結果發(fā)現(xiàn)，水的提取效率為8.12%、乙醇為6.06%、甲醇為8.86%。從經濟和安全角度考慮，認為選擇水作為提取液的試驗效果好、成本低且安全，且溫度為100℃時提取率最高，為9.47%。

關鍵詞 莽草酸 ；八角茴香 ；蒸餾水 ；乙醇 ；甲醇 ；高效液相色譜

分類號 R284.2

Preliminary Study on Extracting Shikimic Acid from Illicium verum

by Different Methods

CHEN Xin1） GONG Jingjing2） PENG Lixu1）

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571737；

2 Linchuan No. 1 High School， Fuzhou， Jiangxi 344100）

Abstract The shikimic acid is the main raw materials of Oseltamivir Phosphate ever since the outbreak of avian influenza all over the world. In this paper， we tested the distilled water， ethanol and methanol extraction effect of shikimic acid in Illicium verum by HPLC and single-factor test. The results showed that the extraction effects were 8.12% （distilled water）， 6.06% （ethanol） and 8.86% （methanol）， respectively. However， distilled water was a kind of preferable extraction solvent in the paper because it is less valuable and much safer than the other solvent candidates. The extraction effect was the best up to 9.47 % at 100 ℃ when distilled water was used as a solvent to extract shikimic acid.

Keywords shikimic acid ； Illicium verum ； distilled water ； ethanol ； methanol ； HPLC

莽草酸（Shikimic acid）是一種極性較大的有機酸。自100多年前從植物中提取出以來，人類對莽草酸的研究就一直沒有停止過[1-4]。禽流感暴發(fā)后，莽草酸作為抗禽流感特效藥達菲的主要原料而受到人們關注。莽草酸主要存在于木蘭科植物八角茴香（Illicium verum）干燥成熟的果實中，是八角茴香里一種重要的生理活性物質，具有抗菌、抗腫瘤、抗血栓形成等多種藥理功能[5-6]。我國有豐富的八角茴香資源，主要分布于福建、廣東、廣西、云南、貴州及臺灣等地[7]。

莽草酸的化學合成方法比較多，主要由奎寧酸合成以及由碳氫化合物合成等[7-13]，但其步驟繁瑣，效率也有所偏低。在莽草酸的合成研究上，瑞士的羅氏公司與德國一家生物技術中心合作開發(fā)了采用基因重組得到的大腸桿菌來生產莽草酸的方法。其中，羅氏公司制造的達菲的莽草酸三分之二來自八角茴香，三分之一由大腸桿菌提供[14]。但是莽草酸的化學合成成本較高。目前，從天然植物八角茴香中提取莽草酸的效率仍然偏低，其提取工藝各方面仍然需較大改良和完善。因此，本文以天然植物八角茴香為原料，采用不同提取液（水、乙醇及甲醇作為候選溶劑），探討從八角茴香中提取莽草酸的效率及最佳工藝條件，為莽草酸的高效提取奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料及試劑

八角茴香（采自江西?。o水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、甲醇（分析純，上海振興化工一廠）、蒸餾水（海南大學農學院實驗室提供）、高氯酸（分析純，上海桃浦化工廠）等。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司），HH-SB數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），臺式干燥箱（WG-2003SBC，重慶四達實驗儀器有限公司），玻璃儀器冷凝回流裝置（RE-52AA，鞏義市英峪予華儀器廠），精密酸度計（PHS-3C型，上海雷磁儀器廠），分析天平（BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），等。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

1.2.1.1 標準溶液配制

水標準溶液配制：稱取0.500 7 g莽草酸標準品粉末放于100 mL蒸餾水中，即為5 000 μg/mL，稀釋100倍得到50 μg/mL溶液，并以此溶液作為莽草酸的標準儲備液。在50 μg/mL儲備液中分別取40、30、20、10、5、1 mL放到50 mL容量瓶中，定容后即可得到一系列標準溶：50、40、30、20、10、5、1 μg/mL的標準溶液。充分搖勻，微孔濾膜濾過，使用高效液相色譜儀進行測定。endprint

乙醇標準溶液配制：稱取0.251 1 g莽草酸標準品放于50 mL乙醇中，得到502 2 μg/mL的乙醇溶液，稀釋100倍即取0.25 mL放入25 mL容量瓶中，即約為50 μg/mL莽草酸的乙醇標準儲備液，其濃度為49.22 μg/mL，然后分別配制49.22、39.37、29.53、19.69、9.84 μg/mL的乙醇標準溶液充分搖勻，微孔濾膜濾過，使用高效液相色譜儀進行測定。

甲醇標準溶液配制：精確稱取莽草酸標準品0.245 1 g，溶于50 mL甲醇中，稀釋100倍，得到莽草酸的標準儲備液，濃度為48.04 μg/mL，然后分別配制成3.20、6.08、12.16、24.12、48.04 μg/mL的甲醇標準溶液，充分搖勻，微孔濾膜濾過，使用高效液相色譜儀進行測定。

高效液相色譜儀配有UV檢測器（SPD-20A型）。色譜柱：C18-ODS柱156 mm×4.6 mm；移動相：高氯酸溶液pH=2.5（用蒸餾水及精密酸度計調配）。流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL/次。

1.2.1.2 莽草酸樣品的提取

取八角茴香粉末3 g（過40目篩），分別添加不同的提取溶劑，每次提取的固液比為1∶20（g∶mL），于60℃加熱回流提取1 h，重復提取3次，合并浸提液，用高效液相色譜測定莽草酸的含量。為避免濃度較高容易出現(xiàn)平頂峰，得到的提取液在進入高效液相色譜儀之前還需要稀釋100倍。

1.2.1.3 不同提取溫度對提取率的影響

取0.5 g八角茴香粉末，以水為提取液，一次回流提取，固液比為1∶20，溫度分別設為40、60、80、100℃，時間設定為1 h。測定方法同莽草酸樣品的提取。

1.2.2 數(shù)據分析

通過Excel 2003與SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

利用高效液相色譜儀對不同溶劑進行測定，通過不同濃度標準溶液的峰高值計算得到水標準溶液標準曲線方程為y=4.072 7x-0.183 3（R2=0.999 9）（圖1），乙醇標準溶液標準曲線方程為y=9.900 4x-9.859 6（R2=0.999 2）（圖2），甲醇標準溶液標準曲線方程為y=1.774x+8.021 5（R2=0.980 2）（圖3）。

2.2 不同溶劑提取莽草酸樣品結果

從水提取莽草酸樣品溶液高效液相色譜圖（圖4）中得到峰高值為165.143 mV，將其代入水溶液標準曲線y=4.072 7x-0.183 3，可以得到該提取液稀釋100倍后的莽草酸濃度為40.59 μg/mL，經過計算得到莽草酸稀釋前的濃度為4 059.38 μg/mL，溶液中莽草酸的質量為0.243 6 g，由此可得水提取法的提取率為8.12%。

將乙醇提取莽草酸樣品溶液高效液相色譜圖（圖5）中的峰高值290.160 mV代入乙醇溶液標準曲線y=9.900 4x-9.859 6。經過計算得到乙醇提取法的提取率為6.06%。甲醇提取莽草酸樣品溶液高效液相色譜圖（圖6），峰高值h=100.180 mV，代入甲醇溶液標準曲線，經過計算提取效率為8.86%。由以上可以看出甲醇溶液的提取率最高，水溶液的提取率其次，而乙醇溶液的提取率最低。由于甲醇毒性大，在實際操作中應盡量避免使用，故本研究選取水溶液作為提取莽草酸樣品的最佳溶液。

2.3 提取方法的比較

取3 g左右八角茴香粉末（過40目篩）、回流提取1 h、液固比20∶1、溫度60℃、一次提取時，比較3種溶劑的提取效率，水、乙醇和甲醇的莽草酸提取效率分別為8.117%、6.059%和8.857%。

單因素實驗結果進行方差分析發(fā)現(xiàn)，用水或甲醇作為溶劑2種方法提取總量差異不顯著（p>0.05），但都極顯著（p<0.01）高于用乙醇作為溶劑時的提取量。由于甲醇有毒性，不利于操作，因此研究認為選擇水作為提取莽草酸的溶劑效果較優(yōu)。

2.4 不同提取溫度對提取率的影響

用水作為溶劑來提取八角茴香中的莽草酸時，在其它條件不變的情況下，提取率隨溫度的升高而緩慢升高，在40℃時，水的提取率為6.32%，在100℃時，水的提取率為9.47%（圖7）。

3 討論與結論

莽草酸對禽流感治療效果十分良好。如何更好地提取、分離莽草酸仍是基礎研究領域的一個難題，仍需科學研究人員進一步摸索和嘗試，從而得到高提取率和高純度的莽草酸?，F(xiàn)在市場上獲得莽草酸的最主要來源是從八角茴香中提取。已有報道中，采用提取法提取莽草酸的方法大致分為醇提取和水提取兩個方法[6]。但是不同文獻中所采用的提取方法與步驟可重復性差，偶然性依然較大。因此，對莽草酸提取的研究還是需要大量、可重復性的試驗給予驗證。

本試驗結果表明，莽草酸的提取率由高至低依次是甲醇溶液的提取率8.86%，水溶液的提取率8.12%，而乙醇溶液的提取率6.06%。從提取率來分析，結果表明采用甲醇提莽草酸的效果>水提取效果>乙醇提取效果。若綜合考慮提取的安全性和經濟性，水作為溶劑的提取效果則優(yōu)于醇類。在本次試驗設定的其它條件不變的情況下，水溫度達到100℃時，提取八角茴香中的莽草酸的含量最高，為9.47%。且水作為提取液具有無毒、對環(huán)境無污染、成本低及提取效率高等優(yōu)點。彌補了甲醇-蒸餾水在成本和安全性上的不足，是一種較好的分析方法。

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