時(shí)建立，彭 喆，郭立輝，李 俊，朱榮生，黃保華

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

豬霍亂沙門氏菌LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用

時(shí)建立1，彭 喆1，郭立輝1，李 俊1，朱榮生1，黃保華2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

利用豬霍亂沙門氏菌lacZ基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了檢測豬霍亂沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）快速檢測方法。此方法特異性好，靈敏度高，將細(xì)菌DNA稀釋到10-8仍可檢出，是PCR方法的1000倍。本研究建立的LAMP方法操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，為臨床檢測豬霍亂沙門氏菌和預(yù)防人豬霍亂沙門氏菌病提供了技術(shù)保障。

豬霍亂沙門氏菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；快速診斷

沙門氏菌是一類對人和動(dòng)物都有致病性的重要的革蘭氏陰性腸桿菌科細(xì)菌，主要引起人和動(dòng)物發(fā)熱、胃腸炎、腹瀉和敗血癥等臨床癥狀，同時(shí)是一種常見的食源性致病菌，污染動(dòng)物性食品感染人類，導(dǎo)致食物中毒，引起敗血癥等，甚至死亡[1-2]，對人和動(dòng)物危害嚴(yán)重。豬霍亂沙門氏菌是引起豬沙門氏菌病的主要血清型，主要感染斷奶期仔豬，引發(fā)仔豬副傷寒，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等為特征，當(dāng)并發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時(shí)時(shí)，死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重困擾著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。在我國，豬沙門氏菌感染率很高，在屠宰中往往污染豬肉，引起人沙門氏菌感染發(fā)病。因此臨床中急需一種敏感快速并且廉價(jià)的豬霍亂沙門氏菌診斷方法。

傳統(tǒng)檢測豬霍亂沙門氏菌的方法有細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定、免疫學(xué)檢測等，如ELISA以及以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)等，此類方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、所需試劑繁多，經(jīng)濟(jì)成本高，并且有設(shè)備和技術(shù)要求，難以在基層推廣普及[3，8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測（LAMP）技術(shù)是2000年由Notomi等建立的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可在等溫條件下通過特異DNA聚合酶作用而實(shí)現(xiàn)對特定核苷酸序列的擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、成本低廉和結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，目前在一些病原微生物檢測中被廣泛應(yīng)用[4，6-7]。本試驗(yàn)針對豬霍亂沙門氏菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因），建立了LAMP快速檢測方法，為臨床檢測豬霍亂沙門氏菌和預(yù)防人豬霍亂沙門氏菌病提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌購自中國科學(xué)院微生物研究所（CGMCC，No. 1.1859和1.1190）；金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、乳酸桿菌等由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存和提供；檢測用豬肉購自實(shí)驗(yàn)室周邊超市和農(nóng)貿(mào)市場；Bst DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2000購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備

采用煮沸法制備靶DNA[9]：挑取豬霍亂沙門氏菌單菌落溶于100μL無菌水混勻后，于100℃水浴25 min裂解，冰浴5 min，然后4℃12 000 r/min離心5 min，取含DNA模板的上清液備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank公布的豬霍亂沙門氏菌lacZ基因序列，利用網(wǎng)http∶//primerexplorer.jp/e/設(shè)計(jì)LAMP特異引物，包括外引物對（F3、B3）和內(nèi)引物對（FIP、BIP）（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 擴(kuò)增lacZ基因的LAMP引物序列

1.2.3 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP基本反應(yīng)體系為25μL，成分包括：內(nèi)外引物、dNTPs、Betaine、Bst DNA 聚合酶、10×ThermoPol buffer 、DNA模板。反應(yīng)溫度在60～65 ℃，擴(kuò)增60 min左右，80 ℃10 min終止反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果。也可在反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管中加入1μL SYBR GeenⅠ核酸染料，肉眼觀察溶液顏色變化，也可在紫外下觀察有無熒光。

以基本反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，為確定最佳擴(kuò)增條件，選擇對LAMP擴(kuò)增反應(yīng)影響較大的幾種因素如反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Betaine濃度和dNTPs濃度進(jìn)行調(diào)整，對各組分進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 LAMP方法靈敏度檢測

取1 mL豬霍亂沙門氏菌液體培養(yǎng)物，用煮沸法制備DNA，以生理鹽水10倍梯度稀釋，分別作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并同時(shí)與檢測沙門氏菌的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 28642-2012）進(jìn)行比較。反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管中加入1μL SYBR GeenⅠ核酸染料，肉眼觀察溶液顏色變化，也可在紫外下觀察有無熒光。確定LAMP反應(yīng)的靈敏度。

1.2.5 LAMP方法特異性檢測

分別對鼠傷寒和豬霍亂沙門氏菌及金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、乳酸桿菌等進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測LAMP引物的特異性。

1.2.6 LAMP方法臨床樣品檢測

對實(shí)驗(yàn)室周邊超市和農(nóng)貿(mào)市場購買的豬肉樣品無菌研磨處理后煮沸法提取DNA進(jìn)行LAMP檢測。對檢測結(jié)果陰性樣品用豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行人工感染后重新進(jìn)行LAMP檢測。

2 結(jié)果

2.1 LAMP條件的優(yōu)化

豬霍亂沙門氏菌LAMP擴(kuò)增陽性結(jié)果在凝膠電泳中呈梯狀條帶，無模板的陰性對照擴(kuò)增無條帶。優(yōu)化結(jié)果顯示：最佳反應(yīng)溫度為63 ℃（圖1A）；dNTPs濃度在0.4 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最亮；betaine濃度在1.2 mol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最亮；擴(kuò)增30 min

即出現(xiàn)穩(wěn)定梯狀條帶，而擴(kuò)增75 min出現(xiàn)最亮條帶（圖1D）。

圖1 優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 LAMP反應(yīng)靈敏度檢測結(jié)果

最終優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為1μL DNA模板，1.5μL FIP 和BIP 引物，0.15μL F3和B3

引 物，4μL dNTPs（10μM），2.5μL 10×ThermoPol buffer，1μL Bst DNA polymerase，6μL Betaine，加入超純水至25μL。各反應(yīng)物在63°C水浴75 min，然后80 ℃ 5 min滅活終止反應(yīng)。

2.2 LAMP反應(yīng)的靈敏度

將豬霍亂沙門氏菌DNA 作10倍梯度稀釋進(jìn)行LAMP 反應(yīng)，結(jié)果DNA稀釋到108倍仍可檢出（圖2A）。擴(kuò)增產(chǎn)物中分別加入SYBR GeenⅠ核酸染料，DNA稀釋108倍擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外下可見熒光（圖2C）。將各稀釋的豬霍亂沙門氏菌DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示PCR法的檢出限為DNA稀釋到10-5（圖2B）。

由上圖可知：LAMP檢測方法的最低檢測量為10-8稀釋，常規(guī)PCR檢測方法的最低檢測量為10-5稀釋，LAMP方法的靈敏度是PCR方法的1 000倍。

2.3 LAMP特異性檢測

對7種菌株用煮沸法提取DNA后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果顯示僅豬霍亂沙門氏菌出現(xiàn)特征性階梯狀擴(kuò)增條帶，而其他菌均未出現(xiàn)梯形條帶（圖3）。

圖3 LAMP特異性檢測結(jié)果

2.4 臨床樣品檢測

從實(shí)驗(yàn)室周邊超市和農(nóng)貿(mào)市場購買的豬肉樣品進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果顯示只有個(gè)別樣品能夠檢測出豬霍亂沙門氏菌。對檢測結(jié)果陰性樣品用豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行人工感染后重新進(jìn)行LAMP檢測，能夠擴(kuò)增出特異的梯形條帶（圖4）。

3 討論

圖4 部分臨床樣品檢測結(jié)果

豬霍亂沙門氏菌宿主范圍較窄，主要導(dǎo)致豬的副傷寒病，臨床癥狀主要表現(xiàn)敗血癥和小腸結(jié)腸癌等，每年給全球的肉豬養(yǎng)殖業(yè)造成重要經(jīng)濟(jì)損失。偶爾感染人類，但是感染后，通常會(huì)造成比較嚴(yán)重的后果[5]，不僅有腸炎等腸胃癥狀，而且在感染后兩、三天內(nèi)導(dǎo)致病人發(fā)燒休克乃至敗血癥、關(guān)節(jié)炎以及骨髓炎。病情發(fā)作急性而且非常嚴(yán)重，特別容易侵犯兩歲以下兒童以及患有免疫缺損的人群，對人類健康造成巨大的威脅。

傳統(tǒng)方法檢測豬霍亂沙門氏菌不僅操作繁瑣，且需要4～7天才能得出明確的診斷結(jié)果，靈敏度很低并且有設(shè)備和技術(shù)要求，難以在基層普及推廣。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP檢測方法只需在63 ℃條件下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增75 min后，再在80 ℃條件下加熱5 min讓酶失活即可，并且LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳或者加入熒光染料的方法觀察結(jié)果。該技術(shù)在等溫條件下即可進(jìn)行核酸的變性和擴(kuò)增，不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中就可完成擴(kuò)增反應(yīng)，適合在食品廠、基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場等基層單位中進(jìn)行快速檢測和推廣應(yīng)用，方便快捷，成本低廉、特異性強(qiáng)，靈敏度是現(xiàn)行沙門氏菌國家標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測方法的1 000倍，對豬霍亂沙門氏菌的有效防控具有重要意義，同時(shí)在豬霍亂沙門氏菌的快速檢測方面具有較好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Application of a Loop-mediated Isothermal Amplif cation Assay for Detection of Salmonella choleraesuis

Shi Jianli1，Peng Zhe1，Guo Lihui1，Li Jun1，Zhu Rongsheng1，Huang Baohua2
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100；2.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan ，Shandong 250100）

Based on the specific primers designed according to the lacZ gene of Salmonella choleraesuis a loopmediated isothermal amplifi cation （LAMP） assay was developed for rapid detection of Salmonella choleraesuis. The result could be observed both with agarose gel electrophoresis and naked eyes. The LAMP assay was of high sensitivity and specificity，and could detect as low as 10-8dilutions. The study provided a very simple and efficient detection method for the clinical diagnosis of Salmonella choleraesuis in food，suitable for rapid detection in laboratories under general conditions.

Salmonella choleraesuis；loop-mediated isothermal amplifi cation assay；rapid detection

S852.61+2

B

1005-944X（2015）08-0068-05

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制崗位（SDAIT-06-021-07）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題

黃保華