張 磊，莫貞峰

（1.濟南市動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250002；2.濟南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,山東濟南 250002）

多重RT-PCR方法診斷多種禽呼吸道病原的混合感染

張 磊1，莫貞峰2

（1.濟南市動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250002；2.濟南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,山東濟南 250002）

在一個RT-PCR反應體系中同時以雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）、雞新城疫病毒（NDV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）和雞滑液囊支原體（MS）等6種呼吸道病原的RNA或DNA為模板進行擴增RT-PCR。結(jié)果顯示，6種病原都擴增出了相應大小的特異性產(chǎn)物，表明建立的多重RT-PCR方法可用于混合感染時上述6種病原的鑒別診斷。

禽呼吸道病原；多重PT-PCR；診斷

禽支原體病是近年來臨床最常見的呼吸道疾病之一，其中MG是造成經(jīng)濟損失最嚴重的一種，臨床稱其為慢性呼吸道病，MS主要引起雞和火雞的滑膜炎和亞臨床的呼吸道癥狀，除家禽支原體外，IBV、AIV、NDV、ILTV也是發(fā)病較多的家禽呼吸道傳染病原，這些病原常常與支原體混合感染發(fā)病，引起癥狀加重，死亡增加[1]。給臨床診斷和治療帶來困難。因此，研究快速、敏感、特異的診斷方法是防治呼吸道疾病的關(guān)鍵。用PCR方法單獨對以上幾種病原進行診斷，已廣泛應用于禽病研究領(lǐng)域，但在一個反應中同時對幾種主要呼吸道病進行診斷，目前還存在一定的困難。這需要多種反應條件的優(yōu)化和無數(shù)次實驗室重復，因此，商品化的診斷試劑盒正在研究中。本文對目前國內(nèi)最常見6種主要呼吸道傳染病病原在同一個RT—PCR反應中檢測，取得了理想的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 病毒株 IBV（Mass）、AIV（I/W/66）、NDV（Lasota）、ILTV、MG（S6）、MS（W.O）等毒株均由美國SPAFAS公司提供

1.2 雞胚

10日齡SPF雞胚，山東省家禽研究所提供。

1.3 試劑

RNA和DNA PCR反應試劑，購自Elmer perlins 公司。

1.4 引物 均由SPAFAS公司合成提供。

病毒 引物 序列 片段大?。╞p）IBV 上游 5’-CAT AAC TAA CAT AAG GGC A-3’ 1720下游 5’-TGA AAA CTG AAC AAA AGA CA-3’AIV 上游 5’-AGC AAA AGC AGG GGA TAC-3’ 550下游 5’-GTC TGA AAC CAT ACC ATC C-3’NDV 上游 5’-GGA GGA TGT TGG CAG CAT T-3’ 300下游 5’-GTC AAC ATA TAC ACC TCA TC-3’ILTV 上游 5’-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3’ 647下游 5’-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3’MG 上游 5’-GGATCCCATCT CGACCAGGAGAAAA-3’ 732下游 5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’MS 上游 5’-GAAGCAAAAT AGTGATATCA-3’ 207下游 5’-GTCGTCTCGAAGTTAACAA-3’

1.5 支原體培養(yǎng)和病毒增殖

支原體培養(yǎng)液由PPLO肉湯，10%滅活馬血清，5%新鮮酵母提取液組成；MS培養(yǎng)液在基礎(chǔ)液的基礎(chǔ)上加0.02%（NAD）。37℃培養(yǎng)96～120h。

4種病毒的種毒分別作10-2稀釋，IBV、AIV、NDV經(jīng)尿囊腔接種，ILTV經(jīng)絨毛尿囊膜接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，37℃孵育48～72h，收獲尿囊液和絨毛膜，反復凍解3次后置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RNA、DNA提取

1.6.1 AIV、NDV、IBV的RNA提取 10mL的病毒尿囊液，2500r/min離心20min，上清移入新的離心管4℃ 20000r/min再離心1h，沉淀用200μL 0.5%DEPC水混懸，加600μL Trizol混勻后至室溫5min，再加200μL氯仿，用手輕輕搖勻，室溫下靜置10min，10000r/min離心15min，上清加入300μL 無水酒精，10000r/min離心10min，沉淀用70%酒精洗滌，工作臺下干燥，最后用50μL DEPC溶解沉淀，37℃孵育20min。

1.6.2 ILTV 的DNA提取 絨毛尿囊膜懸液10mL，2500r/min離心20min，上清4℃ 2000r/min離心1h。

1.6.3 MG、MS的DNA提取 5mL支原體培養(yǎng)液4℃ 10000r/min離心20min，沉淀用500μL TE懸浮，4℃，10000r/min，離心20min。PBS 緩沖液（pH 7.2）洗2次。沉淀用500μL TE懸浮后，加50μL 10%SDS（終濃度1%），5μL蛋 白酶K（20μg/ mL）用手輕輕搖勻，37℃，孵育1h。降至室溫后，加等體積的 酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）抽提3次；2倍體積的冷無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，-20℃過夜。14000r/min離心10min。沉淀用70%乙醇洗滌一次。工作臺下自然干燥，溶解于40μL TE中。55°C孵育30min，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 RT-PCR和多重PCR反應條件

聯(lián)合擴增反應分RT-PCR和PCR兩步進行。RT-PCR在40μL體積內(nèi)進行，每一個反應含有4mM MgCl2，500Mm KCl,150mM Tris-HCl（pH8.0），2mM dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP），2U的RNase抑制物，5U MLV反轉(zhuǎn)錄酶，5U Random Hexamers，6種 病 原 的RNA或DNA模 板 各2μL，DECP處理水加至40μL。3滴礦物油覆蓋液面，42℃ 15min,99℃ 5min,5℃ 5min一個循環(huán)[2]。PCR反應在100μL體積進行，反應中加入4mM MgCl2，500mM KCl,150mM Tris-HCl（pH8.0），6種不同病原的上下引物各1μL，5U Taq DNA聚合酶，DEPC水加至100μL。95℃ 7min使DNA變性；94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2min分別解鏈、退火、延伸進行35個循環(huán)后，72℃再延伸10min，置4℃保存[3]。

1.8 擴增產(chǎn)物檢測

水平凝膠電泳用于DNA產(chǎn)物的檢測。10μL擴增產(chǎn)物加2μL 載樣液，在80V電壓，1%的凝膠上進行電泳。凝膠內(nèi)加入1‰溴乙啶（0.5μg/0.1mL）。電泳液為TBE 緩沖液。紫外線燈下顯示擴增結(jié)果，并一次成像拍照。

2 結(jié)果

在一個RT-PCR反應中同時得到6種呼吸道病原RNA或DNA的擴增產(chǎn)物，圖1顯示了清晰的電泳條帶，IBV為1720bp，AIV為550bp，NDV為300bp，ILTV為647bp，MG為730bp，MS為207bp。用RT-PCR和PCR方法分別對6種不同病原的DNA或RNA擴增的結(jié)果與在同一RT-PCR反應中擴增得到的結(jié)果一致，表明多重PCR方法的特異性和可行性。

3 討論與小結(jié)

圖1 6種呼吸道病原RNA或DNA的擴增產(chǎn)物

家禽呼吸道疾病的混合感染在臨床上非常普遍，特別是在飼養(yǎng)環(huán)境惡劣的條件下，支原體往往首先爆發(fā)繼而其它呼吸道病原乘虛而入，造成兩種或多種病原的混合感染。應用RT-PCR和PCR技術(shù)可及時準確快速地做出診斷，以便正確地采取防治對策，減少不必要的經(jīng)濟損失。多重RT- PCR反應條件復雜，總反應體積較大，樣品DNA的濃度、引物的篩選和濃度對反應至關(guān)重要，但在反復試驗中最大的體會是DNA聚合酶的使用，DNA聚合酶的質(zhì)量和最終濃度是決定試驗成敗的關(guān)鍵因素。用與單獨RT- PCR同樣的條件來處理復合RT- PCR反應很難得到理想的結(jié)果。文中所列RT-PCR的反應條件經(jīng)過多次反復實驗得出的最佳反應條件，其過程不一一贅述。

試驗結(jié)果證明，多重RT- PCR診斷支原體與其他RNA或DNA病毒的混合感染時是特異的，并可節(jié)省時間和費用，值得推廣應用，由于時間所限，我們僅對實驗室的細菌和病毒培養(yǎng)物進行了實驗，取得了滿意的結(jié)果，為下一步的臨床檢測奠定了基礎(chǔ)。

[1] 朱連德. 雞慢性呼吸道病的綜合控制措施[J].中國家禽，1999，21（12）：36-37.

[2] 鄧顯文，謝芝勛，等. PCR和多重PCR技術(shù)對人工感染雞毒支原體SPF雞樣品的檢測[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2005，36（1）：48-50.

[3] Wang X，Khan M I. A multiplex PCR for Massachusetts and Arkansas serotypes of infectious bronchitis virus[J]. Molecular and Cellular Probes，1999，13（1）：1-7.

（責任編輯：胡藕祥）

Application of Multiplex RT-PCR Assay for Detection of Mixed Infection with 6 Avian Respiratory Pathogens

Zhang Lei1Mo Zhenfeng2
（Jinan Animal Disease Prevention and Control Center，Jinan，Shandong 250002；2.Jinan Animal Product Quality and Safety Surveillance Center，Jinan，Shandong 250002）

With DNAs or RNAs of 6 avian respiratory pathogens i.e. infectious bronchitis virus（IBV），avian influenza virus（AIV），Newcastle disease virus（NDV），infectious laryngotracheitis virus（ILTV），Mycoplasma gallisepticum（MG）and Mycoplasma synoviae（MS）as template, amplification was conducted in one multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）system. The result showed that one unique segment was obtained for each of the above 6 pathogens respectively. It was concluded that this established multiplex RT-PCR system could be used for differentiation of complicated infections with MG，MS，AIV，NDV，IBV and ILTV.

avian respiratory pathogen；multiplex RT-PCR；control

S852.65+7

B

1005-944X（2015）08-0076-03