周圓家，鄒 磊，董金波，史晨輝，王維山

miR-146a／27a在SD大鼠OA軟骨、滑膜組織中的表達及意義

周圓家，鄒 磊，董金波，史晨輝，王維山

目的觀察切斷前交叉韌帶（ACLT）構(gòu)建SD大鼠骨性關節(jié)炎（OA）模型的病理特點，并檢測miR-146a和miR-27a在OA動物模型軟骨、滑膜組織中的表達情況方法120只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組行左膝前交叉韌帶切斷術，對照組只打開關節(jié)腔不切斷前交叉韌帶，分別于術后2、4、8周獲取關節(jié)軟骨、滑膜組織，對軟骨情況進行大體及組織學評分，應用RT-PCR檢測軟骨和滑膜組織中miR-146a、miR-27a的表達情況結(jié)果實驗組術后2周軟骨表面粗糙，色澤灰暗，4周和8周病變程度加重，對照組關節(jié)軟骨無明顯退變；實驗組不同時間段Mankin評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。實驗組和對照組2、4、8周時軟骨組織中miR-146a的相對表達量分別為（0．58 ±0．13）vs（0．66±0．14）、（0．43±0．08）vs（0．68±0．12）、（0．18±0．06）vs（0．61±0．07），各個時間點差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；同期檢測到軟骨組織中miR-27a、滑膜組織中miR-146a和miR-27a在實驗組和對照組各時間點的表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。應用Pearson相關分析顯示，miR-146a、miR-27a在軟骨組織中的表達情況與Mankin評分呈顯著負相關（r＝－0．92、－0．89，P＜0．05），而滑膜、軟骨中miR-146a和miR-27a的表達呈線性正相關（r＝0．78、0．80，P＜0．05）結(jié)論miR-146a和miR-27a在SD大鼠OA模型軟骨組織、滑膜組織中呈低表達，且與OA軟骨病變程度呈負相關。

骨關節(jié)炎；微小RNA；軟骨組織；滑膜組織

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性骨關節(jié)病，是一種以關節(jié)軟骨組織發(fā)生退行性病變?yōu)橹饕卣?，并伴隨年齡增長發(fā)病率明顯升高的疾病?？衫奂瓣P節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及關節(jié)周圍肌肉、韌帶。以關節(jié)緩慢發(fā)展的疼痛、腫脹，伴功能障礙為臨床表現(xiàn)，主要有滑膜增生、軟骨破壞、軟骨下骨骨化及骨贅形成等一系列病理表現(xiàn)［1］。由于人們對OA病理變化的具體機制仍然無法確定，因此目前治療仍然以減輕疼痛，減緩關節(jié)功能受損為主，無法達到軟骨正常結(jié)構(gòu)恢復的治愈目標。近年來隨著研究的深入，越來越多的文獻表明蛋白降解酶在OA病理變化過程中發(fā)揮著極其重要的作用，目前研究比較清楚的有基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)（matrix metalloproteinase，MMPs）和纖溶酶原系統(tǒng)。研究［2］表明miRNA也在OA的病變過程中起著關鍵的調(diào)控作用。本課題組前期通過基因芯片技術檢測了OA滑膜組織中miRNA的表達譜發(fā)現(xiàn)，與正?；そM織比較，miR-27a、miR-146a、miR-140、miR-181、miR-182b的表達差異均有統(tǒng)計學意義，其中miR-27a和miR-146a的差異更為明顯，為了進一步驗證二者在OA動物模型中的表達情況，該實驗以切斷SD大鼠膝前交叉韌帶，制作OA模型，應用RT-PCR檢測OA早、中、晚期軟骨及滑膜組織中miR-146a和miR-27a的表達情況，分析其與OA病變的相關性，為后期研究miR-27a和miR-146a在OA中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗動物選取成年雄性SD大鼠120只，體重250～300 g，由新疆自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供。分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食。飼養(yǎng)溫度20～26℃，濕度50%～70%，晝夜節(jié)律按照1∶1進行。將SD大鼠編號后隨機分為模型組和正常組，每組60只。實驗均選取左側(cè)膝關節(jié)作為手術側(cè)。

1．2 主要試劑及儀器miScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（凱杰218161）、miScript SYBR Green PCR檢測試劑盒（凱杰218073）、1%瓊脂糖、漩渦振蕩機（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Heraguard EC超凈工作臺（美國Thermo Scientific公司）；單道可調(diào)移液器（德國Eppendorf艾本德公司）；CFX96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1．3 構(gòu)建SD大鼠OA模型實驗組手術建模過程：將SD大鼠稱重后，按0．3 ml／100 g水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，選取左膝關節(jié)，備皮，消毒。取中立位沿髕韌帶內(nèi)側(cè)弧形微型切開，縱向切開髕旁支持帶，脫位及外翻髕骨，暴露髁間，屈曲關節(jié)維持髕骨脫位，同時用蘸有生理鹽水的紗布保持關節(jié)濕潤，直視下將前交叉韌帶切斷。對照組：只切開關節(jié)腔，不破壞交叉韌帶。分籠飼養(yǎng)，自由活動、飲食，術后3 d肌肉注射青霉素20萬單位預防感染。

1．4 病理學檢測每批10只大鼠，分別于建模手術后2、4、8周取左膝關節(jié)對軟骨情況進行大體觀察。對所取膝關節(jié)，矢狀位切取約5 mm厚帶軟骨下骨質(zhì)的軟骨、滑膜標本，置于10%中性甲醛固定24 h，15%EDTA脫鈣15 d，常規(guī)脫水、石蠟包埋，作5 μm厚度連續(xù)縱切片，行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察組織學病理變化。

1．5 RT-PCR檢測軟骨組織、滑膜組織中miR-146、miR-27a表達應用miScript SYBR Green PCR Kit（200），在熒光定量PCR儀上按照標準步驟進行反應。按照反應體系配置說明配備總反應液25 μl：其中2*Quantiect SYBR Green PCR 12．5 μl；10* miscript Universal Primer 2．5 μl；10*miscript Primer Assay 140／27a／U6 2．5 μl；RNase-free water 5 μl；Template CDNA 2．5 μl，每個樣本設3個復孔，反應條件為：95℃預變5 min，一個循環(huán)。15 s 94℃，30 s 55℃，30 s 70℃，40個循環(huán)。計算2－ΔΔCT值進行定量分析，2－ΔΔCT值表示目的基因相對表達量［3］。

1．6 統(tǒng)計學處理對2－ΔΔCT值采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行分析，正態(tài)分布計量資料以±s表示，基因相對表達量與OA嚴重程度之間的關系采用Pearson相關分析。

2 結(jié)果

2．1 SD大鼠OA關節(jié)軟骨大體形態(tài)學對照組關節(jié)軟骨透明藍白色，關節(jié)面光滑，色澤光亮，無明顯關節(jié)積液及滑膜增生，關節(jié)邊緣整齊。實驗組，術后2周：有少量關節(jié)積液，滑膜輕度充血增生，軟骨面淡黃，觸之輕度變軟。術后4周：滑液增多，滑膜充血增生，軟骨表面粗糙，輕度糜爛，失去原有光澤，色澤變暗。術后8周：滑液相對減少，滑膜增生，軟骨面不規(guī)則，潰瘍形成，部分軟骨下骨暴露，有骨贅形成。各組軟骨退變程度逐漸加重。與對照組比較，實驗組2周時已出現(xiàn)軟骨退行病變，第4、8周時退行性變進一步加重，差異有統(tǒng)計學意義（F＝13．786，P＜0．05），見圖1。

2．2 SD大鼠OA關節(jié)軟骨病理變化正常組：軟骨表面平整，細胞排列整齊，軟骨層次結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整。實驗組4周，淺層軟骨細胞收縮，細胞數(shù)量增多，少量關節(jié)面纖維組織形成，潮線紊亂，染色減退。實驗組6周：表層細胞部分片狀剝脫，部分細胞收縮，細胞核變小，表面部分纖維組織覆蓋，界限模糊。實驗組8周，病變加重，軟骨細胞消失，可深達鈣化層，表層大量纖維覆蓋，軟骨細胞簇集成團，界限不清。各實驗組軟骨細胞退變加重。光鏡下對軟骨退變損傷程度進行Mankin評分，實驗組ACLT術后各時間點軟骨Mankin評分與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝104．252，P＜0．01）。實驗組組間比較Mankin評分隨病程延長分值增加，符合骨性關節(jié)炎軟骨退變的特點。見圖2。

2．3 miR-146a在SD大鼠OA關節(jié)軟骨、滑膜組織中表達軟骨組織中，對照組miR-146a 2、4、8周的表達量差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．875，P＝0．428），實驗組各個時間點之間的差異有統(tǒng)計學意義（F＝44．417，P＜0．001）?；そM織中，對照組miR-146a 2、4、8周的表達量差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．092，P＝0．913），實驗組各個時間點之間的差異有統(tǒng)計學意義（F＝15．857，P＜0．05），隨著時間的延長，實驗組miR-146a在軟骨和滑膜組織中的表達量呈降低趨勢。見圖3。

2．4 miR-27a在SD大鼠OA關節(jié)軟骨、滑膜組織中表達軟骨組織中，對照組miR-27a 2、4、8周的表達量差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．059，P＝0．943），實驗組各個時間點之間的差異有統(tǒng)計學意義（F＝32．141，P＜0．01）?；そM織中，對照組miR-27a 2、4、8周的表達量差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．059，P＝0．943），實驗組各個時間點之間的差異有統(tǒng)計學意義（F＝32．141，P＜0．01），隨著時間的延長，實驗組miR-27a在軟骨和滑膜組織中的表達量呈降低趨勢。見圖4。

2．5 miR-146a／27a與關節(jié)軟骨病變程度的相關性

應用Pearson相關性分析顯示，miR-146a、miR-27a在軟骨組織中的表達情況與Mankin評分呈顯著負相關性（r＝－0．92、－0．89，P＜0．05），而滑膜、軟骨中miR-146a和miR-27a的表達呈線性正相關性（r＝0．78、0．80，P＜0．05），見圖5。

3 討論

OA是機械力學和生物學因素共同作用的結(jié)果，目前具體病變機制還未明確。由于在臨床上難以獲取正常人及早期OA患者的軟骨、滑膜組織標本，為此借鑒Tochigi et al［4］建立的新西蘭大白兔OA模型，本實驗對SD大鼠采用前交叉韌帶切斷術，造成膝關節(jié)受力改變，實為創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎，主要是在生物力學紊亂基礎上的生物學反應所致OA，且隨著時間的延長關節(jié)穩(wěn)定性越差，OA的癥狀越重。

miRNA作為新的調(diào)控因子在關節(jié)軟骨基質(zhì)破壞、軟骨細胞凋亡以及滑膜炎癥等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。近年來確立了miRNA在人類疾病發(fā)病機制中起著至關重要的作用［5－6］。miRNA是真核生物基因表達的一類負調(diào)控因子，具有高度的生物進化保守性、組織特異性、空間和時間特異性、基因簇集現(xiàn)象等生物學特性［7］。Nakasa et al［8］對OA患者軟骨細胞miR-146a基因表達譜的研究表明OA輕度患者的軟骨細胞中miR-146a呈高表達，且miR-146a的表達受IL-1的影響。該研究表明miR-146a是骨關節(jié)炎涉及軟骨病變的基因作用靶點。Jones et al［9］研究顯示在OA早期階段，miR-146a與NF-κB途徑中多個基因密切關聯(lián)，但在中、晚期OA患者軟骨細胞中miR-146a的表達受抑制。miR-146a的表達減少是可能促進OA發(fā)展的影響因素。Yamasaki et al［10］同樣也發(fā)現(xiàn)miR-146a在Mankin評分低的OA軟骨組織中呈高表達，且伴隨Mankin評分的增高及MMP-13的表達增加而呈逐漸下調(diào)趨勢。miR-146a在OA軟骨中的表達變化是關節(jié)軟骨降解與合成之間代謝失衡的一種表現(xiàn)。

Kim et al［11］發(fā)現(xiàn)miR-27a過氧化物酶體生物激活受體-γ抑制脂肪細胞分化，而肥胖是膝關節(jié)等負重關節(jié)發(fā)生OA的危險因素之一［12］。Tardif et al［13］研究表明在OA早期軟骨細胞中高表達雖差異無統(tǒng)計學意義，但在細胞中加入抗miR-27a的物質(zhì)后，其對MMP-13的表達在48～72 h呈現(xiàn)了明顯上升趨勢，據(jù)此推測miR-27a可能間接參與MMP-13的調(diào)控，加速了關節(jié)軟骨破壞進程。

本研究也顯示miR-146a和miR-27a在實驗組的表達明顯低于對照組，且隨著時間的延長其表達量呈現(xiàn)降低趨勢，對其與Mankin評分相關性進行統(tǒng)計分析顯示，miR-146a、miR-27a在軟骨組織中的表達情況與Mankin評分呈顯著負相關性，伴隨Mankin分值的增加呈低表達，表明miR-146a和miR-27a的表達與OA的嚴重程度呈負相關。

OA的病理基礎是關節(jié)軟骨基質(zhì)中的蛋白聚糖和膠原纖維網(wǎng)的降解，使關節(jié)軟骨退變、結(jié)構(gòu)破壞，并引起滑膜炎癥。以uPA為代表的絲氨酸蛋白水解酶，可介導細胞外基質(zhì)蛋白的水解并參與關節(jié)軟骨的細胞外基質(zhì)降解及關節(jié)滑膜增生，在OA的病理過程中起重要作用［14］，本研究前期也初步探討了miR-27a、miR-140、uPA和MMP-3在OA病理變化中起著重要的作用，并且相互之間存在某種調(diào)控關系［15］。通過本次研究也表明，miR-146a和miR-27a參與OA的病理變化過程。但是有關其在OA病理變化中的具體機制及與其他因素的相互關系，有待進一步實驗證實。

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Expression and significance of miR-146a，miR-27a in the cartilage and synovial of SD rat model of osteoarthritis

Zhou Yuanjia，Zou Lei，Dong Jinbo，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of Shihezi University，Shihezi 832000）

ObjectiveTo observe anterior cruciate ligament transection（ACLT）to build clinical pathological features of SD rat model of osteoarthritis（OA），and to examine the expression of miR-146a and miR-27a in joint cartilage and synovial of SD rat model of OA．Methods Experimental groups received unilateral ACLT，the treatment of control groups was similar to the experrnental groups，but no transction ACL，and they were sacrificed at 2，4 and 8 weeks after surgery respectively．Knees were harvested to observe the pathologic change of cartilage macroscopically and histologically，histopathological grading OA was performed according to a Mankin＇s scoring system．The expression levels of miR-146a and miR-27a in joint cartilage and synovial were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction．Results Two weeks after ACLT cartilage surface roughness and color gloomy were seen，and became more severe at 4 and 8 weeks after operation，while cartilage still remained normal after pseudo operation．Mankin score of the experimental groups in different time periods were significant differences with the control groups．In the experimental and control groups，the relative expression levels of miR-146a at 2，4，8 weeks in joint cartilage were（0．58±0．13）vs（0．66±0．14），（0．43±0．08）vs（0．68±0．12），（0．18± 0．06）vs（0．61±0．07），and each time point that had statistically significant differences（P＜0．01）．At the same period detected cartilage tissue miR-27a，synovial tissue miR-146a and miR-27a，there were statistically significant differences at each time point between the expression of the experimental groups and the control groups（P＜0．01）．Application pearson correlation analysis showed that the expression levels of miR-146a and miR-27a in cartilage tissue were significantly negatively correlated to Mankin score（r＝－0．92，－0．89，P＜0．05），while the expression levels of miR-146a，miR-27a in synovium and cartilage were significantly positive correlation（r＝0．78，0．80，P＜0．05）．Conclusion The expression levels of miR-146a and miR-27a decreased in joint cartilage and synovial in SD rat model of OA，and that were negatively related to the severity of OA．

osteoarthritis；miRNA；cartilage；synovial

R 684．3

A

1000－1492（2015）03－0275－05

2014－11－13接收

國家自然科學基金（編號：81160225、81360451）；兵團醫(yī)藥衛(wèi)生專項資助課題（編號：2013BA020）；兵團國際交流與合作專項資助課題（編號：2012BC002）；兵團創(chuàng)新團隊專項課題（編號：2014CC002）

新疆石河子大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，石河子 832000

周圓家，男，碩士研究生；王維山，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wwsmc2002＠sina．com