章成芳，馬筱玲，戴春陽(yáng)，孫曉曦

rLukS-PV體外誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞THP-1分化作用研究

章成芳，馬筱玲，戴春陽(yáng)，孫曉曦

目的研究金黃色葡萄球菌PV-殺白細(xì)胞毒素亞組分（LukS-PV）對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞THP-1的誘導(dǎo)分化作用，為尋求白血病新的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)方法分別采用0、0．50、1．00、1．50 μmol／L體外重組PV-殺白細(xì)胞毒素亞組分LukS-PV（rLukS-PV）體外刺激THP-1細(xì)胞24、48 h。倒置顯微鏡、瑞氏－吉薩姆染色鏡檢等方法觀(guān)察rLukSPV作用前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗原CD11b、CD14，熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞吞噬功能結(jié)果經(jīng)rLukS-PV刺激的THP-1細(xì)胞由分散、懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)轲じ?、貼壁，且呈梭形。細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增多，核質(zhì)比例縮小，細(xì)胞核呈腎形、三角形或不規(guī)則形，偏于一側(cè)。細(xì)胞表面CD11b、CD14表達(dá)增加，以CD14增加較為顯著，細(xì)胞對(duì)熒光顆粒吞噬功能明顯增強(qiáng)。以上作用有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性結(jié)論rLukS-PV具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞定向分化的作用，有望成為一種新的髓系白血病靶向治療藥物。

PV-殺白細(xì)胞毒素；THP-1細(xì)胞；誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)分化療法是當(dāng)前白血病治療的主要方法之一。該方法與傳統(tǒng)的化療區(qū)別在于不殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)其向正?；蚪咏５募?xì)胞分化，同時(shí)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性表型。全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）為研究較為廣泛的分化誘導(dǎo)劑之一，在臨床上用于誘導(dǎo)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病已取得了較高的完全緩解率［1］，但該藥對(duì)其他亞型急性髓系白血病療效不佳，且存在容易復(fù)發(fā)和產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，所以尋找新的白血病治療誘導(dǎo)劑是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的PV-殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）兩個(gè)組分之一。PV-殺白細(xì)胞素是一種細(xì)胞穿孔毒素，含有LukS-PV（33 ku）和LukF-PV（34 ku）兩個(gè)組分，研究［2］表明，單組分rLukS-PV對(duì)靶細(xì)胞的毒性明顯減低，但仍保留誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的活性。本實(shí)驗(yàn)組前期已研究證實(shí)rLukS-PV具有抑制THP-1細(xì)胞增殖誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯等作用［3］。但對(duì)于重組PV-殺白細(xì)胞毒素亞組分LukS-PV（recombinant LukS-PV，rLukS-PV）是否具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的作用未見(jiàn)研究報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)以原單核白血病細(xì)胞株THP-1為模型，對(duì)rLukS-PV誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 材料白血病細(xì)胞株THP-1（中科院上海細(xì)胞研究所）；RPMI 1640培養(yǎng)基和新生胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；蛋白純化試劑盒（德國(guó)Novagen公司）；FITC偶聯(lián)的抗人CD11b單克隆抗體、PE偶聯(lián)的抗人CD14單克隆抗體（美國(guó)eBioscience公司）；0．5 μm綠色熒光顆粒（美國(guó)Polysciences公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板（美國(guó)Corning公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；EPICS XL-2流式細(xì)胞儀（美國(guó)COULTER公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含100 U／ml青霉素G、100 μg／ml鏈霉素和10%胎牛血清）培養(yǎng)，并置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1．2．2 rLukS-PV蛋白的表達(dá)與純化及蛋白的定量

本課題組前期構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-LukSPV，并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌（E．coli）BL21（DE3），－80℃凍存。按常文嬌等［4］實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行rLukSPV蛋白表達(dá)和純化。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)重組蛋白濃度。

1．2．3 rLukS-PV刺激THP-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5× 105～10×105／ml，分別加入0（對(duì)照組）、0．50、1．00、1．50 μmol／L rLukS-PV與細(xì)胞共培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48 h后，通過(guò)相差顯微鏡、瑞氏染色鏡檢等方法觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)改變。

1．2．4 細(xì)胞表面特異性抗原的檢測(cè) 收集rLukSPV與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞懸液，1 000 r／min離心5 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入5 μl FITC-CD11b和5 μl PE-CD14熒光抗體雙標(biāo)樣品細(xì)胞，4℃避光孵育30 min，預(yù)冷PBS洗滌1次，200 μl PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。

1．2．5 細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè) 根據(jù)Gaurnier-Hausser et al［5］實(shí)驗(yàn)方法，將0．5 μm的綠色熒光顆粒稀釋濃度為5×1011／ml，向各組細(xì)胞中加入熒光顆粒，濃度為25 μl／ml培養(yǎng)液，37℃孵育2 h，收集細(xì)胞，冷PBS洗滌5次去除未吞噬熒光顆粒，熒光顯微鏡涂片觀(guān)察細(xì)胞吞噬功能。

1．2．6 qRT-PCR檢測(cè)信號(hào)通路基因表達(dá) 收集rLukS-PV與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)abm EvaGreen 2X qPCR MasterMix實(shí)驗(yàn)方法，以β-actin作為內(nèi)參，使用ABI7500PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組數(shù)據(jù)之間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察原單核白血病細(xì)胞THP-1正常情況下呈圓形，懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)rLukS-PV作用后，部分THP-1細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，且形狀呈梭形。形態(tài)學(xué)上具有向巨噬細(xì)胞分化的特征。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，48 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)程度及數(shù)量明顯高于24 h；且隨著rLukS-PV作用濃度的增加，細(xì)胞貼壁程度增加。rLukS-PV誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。rLukS-PV作用THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞涂片進(jìn)行瑞氏染色，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化。表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增多，核質(zhì)比例縮小，核偏于一側(cè)，細(xì)胞核呈腎形、三角形或不規(guī)則形。且隨著作用時(shí)間和作用劑量增加，細(xì)胞分化增多，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖2、3。

2．2 細(xì)胞表面抗原CD11b和CD14的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rLukS-PV處理THP-1細(xì)胞后細(xì)胞表面抗原CD11b和CD14的表達(dá)，結(jié)果顯示，rLukS-PV作用THP-1細(xì)胞24、48 h后，其表面抗原CD11b和CD14表達(dá)率均有增加，且CD14顯著增加。見(jiàn)圖4、5。作用48 h后，CD11b和CD14的表達(dá)均較24 h上調(diào)，呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。在同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度rLukS-PV（0、0．50、1．00、1．50 μmol／L）實(shí)驗(yàn)組CD11b和CD14表達(dá)均隨rLukS-PV濃度的增加而增加（F24＝36．53、F48＝26．57，P＜0．01；F24＝46．48、F48＝277．20，P＜0．01）。見(jiàn)圖6結(jié)果提示rLukS-PV具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的潛能，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。

2．3 細(xì)胞吞噬功能的改變?yōu)檫M(jìn)一步驗(yàn)證rLukSPV對(duì)THP-1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，熒光顆粒吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rLukS-PV刺激后的細(xì)胞吞噬功能結(jié)果顯示經(jīng)rLukS-PV作用后，THP-1細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)熒光顆粒的吞噬功能，且隨著作用時(shí)間和作用劑量增加，細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖7。

2．4 MAPK信號(hào)通路基因的變化為研究rLukSPV誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的作用機(jī)制，qRT-PCR檢測(cè)MAPK信號(hào)通路基因表達(dá)結(jié)果顯示經(jīng)rLukSPV刺激THP-1細(xì)胞48 h后，p38、JNK1、JNK2、ERK1、ERK2表達(dá)量均明顯上調(diào)，且其下游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Fos、Jun、c-myc、ATF2表達(dá)量也明顯升高。見(jiàn)圖8。

3 討論

LukS-PV和LukF-PV同比例混合時(shí)，高濃度時(shí)可使細(xì)胞穿孔溶解（壞死），低濃度時(shí)則誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］。本課題前期成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-LukS-PV，體外表達(dá)純化重組蛋白LukSPV，研究［3］表明，rLukS-PV細(xì)胞毒性明顯減低，且體外可以誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞THP-1凋亡及細(xì)胞周期阻滯，抑制其增殖，具有抗白血病細(xì)胞生長(zhǎng)活性。

白血病發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制與細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化異常密切相關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化療法是白血病治療的新策略，該方法基本特點(diǎn)在于不殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)其向正?；蚪咏５募?xì)胞分化，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［7］。本研究首次以人單核白血病細(xì)胞株THP-1為模型，通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面抗原表達(dá)、吞噬功能等方法，研究rLukS-PV誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化作用結(jié)果顯示，rLukS-PV作用一段時(shí)間后，THP-1細(xì)胞部分呈梭形，有偽足，貼壁生長(zhǎng)。瑞氏染色觀(guān)察到rLukS-PV處理后THP-1細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增多，核質(zhì)比例減小，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，位于一側(cè)，表現(xiàn)出明顯的巨噬細(xì)胞形態(tài)特征。

CD11b是細(xì)胞黏附分子整合蛋白家族成員之一MAC-1（CD11b／CD18）的α鏈，它主要在成熟單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)，是單核／巨噬分化的標(biāo)志。CD14為L(zhǎng)PS受體，主要功能是結(jié)合LPS并引起細(xì)胞活化［8］，主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面，是單核／巨噬分化的主要標(biāo)志。rLukS-PV刺激THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞表面抗原CD14表達(dá)明顯上調(diào)，且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，在1．50 μmol／L rLukS-PV刺激THP-1細(xì)胞48 h后，CD14表達(dá)比例最高，可達(dá)24．3%。本研究中rLukS-PV誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化表現(xiàn)出與PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化同樣的表型改變，進(jìn)一步證實(shí)了rLukS-PV誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化向巨噬細(xì)胞分化方向。

巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，為驗(yàn)證THP-1細(xì)胞分化后功能的變化，檢測(cè)了rLukS-PV作用后THP-1細(xì)胞對(duì)0．5 μm綠色熒光顆粒的吞噬作用，結(jié)果顯示，經(jīng)rLukS-PV誘導(dǎo)后，THP-1細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光顆粒吞噬功能，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。綜合形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)及吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共同證實(shí)rLukS-PV體外誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化作用，并且誘導(dǎo)效率隨時(shí)間和濃度的增加而增加，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過(guò)程。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPK亞族主要包括ERK1／2、JNK、p38和ERK5，這幾條通路之間存在相互“對(duì)話(huà)”從而導(dǎo)致通路間產(chǎn)生相互協(xié)同或抑制作用。研究［9］表明，維生素D3誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL60和U937粒系分化，主要作用機(jī)制是激活ERK1／2、JNK、p38信號(hào)通路并激活其下游轉(zhuǎn)錄因子如c-jun和ATF-2的磷酸化。在本研究中，THP-1細(xì)胞經(jīng)rLukS-PV作用后，p38、JNK1／2、ERK1／2基因表達(dá)明顯上調(diào)，且轉(zhuǎn)錄因子Fos、Jun、c-myc、ATF2表達(dá)增加。因此猜想，rLukS-PV有可能是通過(guò)激活ERK1／2、JNK、p38信號(hào)通路，進(jìn)而激活其下游轉(zhuǎn)錄因子如Fos、Jun的磷酸化，從而達(dá)到誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的效果。

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rLukS-PV induces differentiation function in human acute myeloid leukemia THP-1 cells in vitro

Zhang Chengfang，Ma Xiaoling，Dai Chunyang，et al
（Dept of Laboratory Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the induction differentiation effect of the subunit of Panton-Valentine leukocidin（LukS-PV）on the acute myeloid leukemia THP-1 cell lines and search a promising therapeutic strategy of myeloid leukemia．Methods THP-1 cells were treated with different concentrations（0，0．50，1．00，1．50 μmol／L）ofrecombinant LukS-PV（rLukS-PV）．After 24，48 h，the morphology of induced cells was observed with Wright-Giemsa staining under optical microscope．The expression of differentiation markers CD14 and CD11b was determined by flow cytometry．The cell phagocytosis of fluorescent particles was examined by fluorescence microscope．Results THP-1 cells treated with rLukS were changed from dispersal and suspended into adhesive and fusiform．Cell volume and cytoplasm content increased，nucleo-cytoplasmic ratio decreased．The shape of cell nucleus was reniform，triangle and irregular．The cell nucleus was located at the side of cells．The expression of CD11b and CD14 was significantly increased，especially CD14．The cell phagocytosis of fluorescent particles was also obviously enhanced．The above effects were both in a dose-and time-dependent manner．Conclusion rLukS-PV has the differentiation effect of inducing THP-1 cell lines into monocyte-macrophages system．These findings suggest the rLukS-PV maybe as a novel approach for treatment of myeloid leukemia．

rLukS-PV；THP-1 cell；induce differentiation

R 733．713

A

1000－1492（2015）03－0280－06

2014－11－23接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085MH188）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001

章成芳，女，碩士研究生；馬筱玲，女，教授，研究生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiaolingma＠126．com