黃娜娜，張逸寅，顧康生

順鉑耐藥人胃癌細(xì)胞SGC-7901的耐藥特性的研究

黃娜娜，張逸寅，顧康生

目的研究人胃癌細(xì)胞SGC-7901順鉑耐藥后的細(xì)胞特性的變化方法用彗星實驗（SCGE）觀察SGC-7901與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥細(xì)胞株（SGC-7901／DDP）的DNA損傷修復(fù)的能力，觀察SCGE檢測圖像的尾長評定DNA的修復(fù)能力；通過觀察胃腺癌SGC-7901細(xì)胞和SGC-7901／DDP的形態(tài)學(xué)不同，比較SGC-7901和SGC-7901／DDP自身變化；用細(xì)胞劃痕的方法檢測SGC-7901／DDP和SGC-7901的遷移能力，通過對其遷移能力的觀察，初步評價兩株腫瘤細(xì)胞的侵襲能力；MTT法分別檢測臨床常用化療藥物5-氟尿嘧啶、依托泊苷、表阿霉素、多西紫杉醇、奧沙利鉑對SGC-7901／DDP的敏感性和IC50，觀察這些藥物對SGC-7901／DDP的敏感性和交叉耐藥性結(jié)果人胃腺癌SGC-7901／DDP較SGC-7901的SCGE圖像的尾長短，SGC-7901／DDP的DNA損傷修復(fù)能力比SGC-7901強(qiáng)，表明順鉑耐藥與其DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)；SGC-7901／DDP和SGC-7901的形態(tài)不同，SGC-7901／DDP SGC-7901體積較小、核分裂較多；通過用細(xì)胞劃痕的方法觀測到SGC-7901／DDP較SGC-7901的遷移能力變差；SGC-7901／DDP對5-氟尿嘧啶、依托泊苷、表阿霉素、多西紫杉醇、奧沙利鉑有不同程度的交叉耐藥性，其IC50較SGC-7901明顯增加結(jié)論人胃癌細(xì)胞SGC-7901對順鉑耐藥可使DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，并具有多重耐化療藥性，但其細(xì)胞的遷移能力減弱。

胃腫瘤；多藥耐藥性；順鉑耐藥性；彗星實驗

順鉑是胃癌基礎(chǔ)化療藥物，但是一些腫瘤患者對順鉑耐藥，減弱順鉑的療效。腫瘤化療藥物的多藥耐藥是指對一種藥物具有耐藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的抗腫瘤藥物也具有耐藥性。多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因之一［1］。該研究主要觀察順鉑耐藥細(xì)胞（SGC-7901／DDP）的耐藥特性，主要包括SGC-7901在對順鉑耐藥的同時對其他胃癌常用化療藥的耐藥情況，及SGC-7901／DDP與SGC-7901在DNA損傷修復(fù)能力及其遷移能力方面的差異，觀察SGC-7901在產(chǎn)生順鉑耐藥的過程中其他的一些細(xì)胞特性的變化，旨在為進(jìn)一步研究胃癌細(xì)胞SGC-7901對順鉑耐藥的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和SGC-7901／DDP均購自南京凱基生物公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS為本實驗室配置；順鉑、依托泊苷購自山東齊魯藥業(yè)；奧沙利鉑、吉西他濱購自江蘇恒瑞生物有限公司；5-氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸有限公司；多西紫杉醇購自英國安萬特公司；MTT、正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、肌氨酸鈉、Triton X-100、EB、EDTA-2Na、二甲基亞礬（DMSO）均購自美國Sigma公司。

1．2 主要儀器穩(wěn)定電泳裝置購自北京六一儀表廠；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；顯微成像系統(tǒng)購自日本佳能公司；ELX-800 UV酶標(biāo)儀購自美國BIO-TEK公司。

1．3 方法

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞株和SGC-7901／DDP培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液（90%）和胎牛血清（10%）、青霉素100 U／ml、鏈霉素100 U／ml的混合培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃的溫箱培養(yǎng)。SGC-7901／DDP在無藥物培養(yǎng)基連續(xù)培育7 d，然后將順鉑（終濃度800 ng／ml）添加到SGC-7901／DDP的RPMI-1640培養(yǎng)基。2～3 d進(jìn)行一次消化傳代，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1．3．2 彗星實驗（single cell gel electrophoresis，SCGE） 取處于對數(shù)生長期的SGC-7901和SGC-7901／DDP細(xì)胞，以0．25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)基制備成濃度為1×105個／ml單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率＞90%進(jìn)行SCGE。取110 μl已熔化的0．5%正常熔點瓊脂糖澆注到全磨砂載玻片上，4℃固化10 min后，依次加入10 μl細(xì)胞懸液與75 μl 0．5%低熔點瓊脂糖的混合液，4℃固化10 min，固化后的玻片沉浸在細(xì)胞裂解液中，4℃避光裂解1 h。PBS清洗載玻片后用堿性電泳液浸沒載玻片4℃避光解旋DNA 20 min。將電泳儀電壓維持25 V，電流維持在0．3 A，恒壓恒流4℃電泳25 min，注意避光操作。然后用中和緩沖液（pH 7．4）漂洗，用甲醇固定，滴加30 μl濃度為20 μg／ml的EB染液進(jìn)行染色。400倍熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)顯像，隨機(jī)轉(zhuǎn)動視野拍攝30個細(xì)胞的SCGE檢測圖像，實驗獨立重復(fù)3次［2］。

1．3．3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 通過倒置顯微鏡下觀察SGC-7901和SGC-7901／DDP形態(tài)的不同，拍照記錄。

1．3．4 細(xì)胞劃痕實驗 取狀態(tài)良好的人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和SGC-7901／DDP，胰蛋白酶消化，5 ×106個／ml制備接種到24孔板，5%CO2、37℃的溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞長成單層后丟棄介質(zhì)，用滅菌槍頭借助無菌尺在每孔的底部中間劃一個“十”字傷口，用PBS輕輕清洗3遍，洗去懸浮的細(xì)胞，每孔加入2 ml的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于0、12、24 h在交叉處拍照［3］，利用Image pro plus軟件測量劃痕的間距，細(xì)胞劃痕遷移率（%）＝（0 h劃痕的間距－不同時間點的劃痕間距）／0 h劃痕的間距× 100%，每次實驗做3個復(fù)孔，實驗獨立重復(fù)3次。

1．3．5 MTT法檢測藥物的敏感性 取狀態(tài)良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901／DDP，將濃度為7× 104個／ml的細(xì)胞加入到96孔板中，每孔100 μl體積，過夜培育。當(dāng)達(dá)到80%～90%細(xì)胞密度，加化療藥物干預(yù)，并設(shè)置不同濃度（以上每組3個平行孔）48 h，同時設(shè)置調(diào)零孔和無藥物孔。順鉑（0．03、0．3、3、30、60 μg／ml）、5-氟尿嘧啶（0．1、1、10、100、200 μg／ml）、依托泊苷（5、10、20、40、80 μg／ml）、表阿霉素（0．01、0．1、1、10、100 μg／ml）、多西紫杉醇（5、10、20、40、80 μg／ml）、奧沙利鉑（5、50、100、200、400 μg／ml）。在實驗孔加入MTT（5 mg／ml）20 μl，37℃培育4 h，注意避光操作。結(jié)束培育，將上清液完全吸去，各孔加入DMSO 150 μl，振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫吸附法在570 nm波長檢測各孔光密度值（optical density，OD），求3孔的平均值，實驗獨立重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組OD平均值／對照組的OD平均值）× 100%，同時計算出各類藥物的半數(shù)抑制率（half maximal inhibitory concentration of a substance，IC50），細(xì)胞對不同藥物的耐藥倍數(shù)＝SGC-7901／DDP對不同化療藥物的IC50／SGC-7901對化療藥物的IC50。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以±s表示，單變量兩組之間的比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和SGC-7901／DDP的DNA損傷修復(fù)能力的差異SCGE的結(jié)果是利用CASP軟件分析尾長作為DNA損傷與修復(fù)的評價指標(biāo)。人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901和SGC-7901／DDP的彗星尾長分別為29．71±4．45和20．38±3．48（t＝16．67，P＜0．05），見圖1、2。

2．2 細(xì)胞形態(tài)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞顯微鏡下觀察為單層、形狀規(guī)則、大小均勻、高折射率、細(xì)胞邊界、核大、圓形或橢圓形；人胃癌SGC-7901／DDP細(xì)胞呈不規(guī)則、細(xì)胞大小不均一、多核、折光度低，見圖3。

2．3 細(xì)胞劃痕實驗用顯微鏡測量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901／DDP在0、12、24 h細(xì)胞劃痕的寬度，結(jié)果顯示：SGC-7901細(xì)胞12、24 h劃痕寬度比SGC-7901／DDP細(xì)胞劃痕寬度明顯縮小（F＝77．12，P＜0．05），SGC-7901的遷移能力比SGC-7901／DDP的遷移能力強(qiáng)，見圖4、5。

2．4 胃腺癌SGC-7901／DDP對各類化療藥的敏感性人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901和SGC-7901／DDP對不同藥物的敏感性，順鉑、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、依托泊苷、多西紫杉醇對順鉑耐藥株及其親本細(xì)胞SGC-7901的IC50和耐藥倍數(shù)見表1，SGC-7901／DDP對順鉑耐藥的同時對表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奧沙利鉑也具有不同程度的耐藥。

3 討論

目前已有大量的實驗［4－5］致力于對順鉑耐藥性的研究，其中DNA的損傷修復(fù)作用引起廣泛關(guān)注，核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）是DNA修復(fù)的重要途徑，核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross-complementing gene1，ERCC1）蛋白是順鉑誘導(dǎo)NER中的關(guān)鍵酶，ERCC1是可以識別DNA損傷和斷開鏈間交聯(lián)的功能，研究［6］表明，ERCC1 mRNA和蛋白的過表達(dá)使DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)與臨床胃癌患者順鉑化療療效呈負(fù)相關(guān)性。然而，目前對NER能力的檢測多用于臨床胃癌組織，無法反映腫瘤的生物學(xué)行為發(fā)生變化所導(dǎo)致的NER的變化，有學(xué)者提出外周血淋巴系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞攜帶有同源基因，均具有相同的NER系統(tǒng)［7］。

表1 不同藥物對SGC-7901／DDP的IC50（μg／ml，±s）

與SGC-7901比較：*P＜0．05

項目SGC7901／DDPSGC7901耐藥倍數(shù)順鉑12．54±0．00*0．27±0．0262．7表阿霉素2．37±0．76*1．68±0．421．4 5-氟尿嘧啶7．92±0．09*0．95±0．148．0奧沙利鉑619．91±1．02*509．30±0．651．2依托泊苷25．89±0．56*10．37±0．372．5多西紫杉醇12．17±0．08*5．82±0．062．1

本研究以人胃腺癌SGC-7901及其順鉑耐藥株SGC-7901／DDP作為研究對象，用SCGE的方法檢測在人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株和其順鉑耐藥株SGC-7901／DDP的DNA修復(fù)能力，結(jié)果顯示人胃腺癌SGC-7901／DDP較其親本細(xì)胞的DNA修復(fù)能力強(qiáng)；此結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的DNA的修復(fù)能力與對順鉑的敏感性呈負(fù)相關(guān)，與臨床研究［8］結(jié)果一致。同時本研究在表明人胃腺癌SGC-7901順鉑耐藥后其DNA修復(fù)能力增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，用MTT的方法檢測SGC-7901順鉑耐藥株對其他化療藥物的敏感性是否發(fā)生變化，結(jié)果顯示SGC-7901／DDP對順鉑耐藥的同時對表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷等也具有不同程度的耐藥，可能由于表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西紫杉醇均通過與DNA作用而發(fā)揮細(xì)胞毒性，由于胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株的DNA修復(fù)能力增強(qiáng)，一定程度抑制其發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，并且有研究［9－11］表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)順鉑積累的減少，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要原因，多藥耐藥基因1是編碼P糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drug resistance-associated protein，MRP）的基因，P糖蛋白是一種跨膜蛋白，其通過ATP供能，將藥物泵出細(xì)胞；MRP也是一種能量依賴的運輸?shù)鞍?，其主要是識別與谷胱甘肽形成MRP-1-ATP，自動把藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而讓細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，藥物抵制腫瘤的影響削弱甚至消失，使細(xì)胞獲得耐藥性。本研究通過細(xì)胞劃痕實驗顯示SGC-7901／DDP的遷移能力較正常的胃癌細(xì)胞株SGC-7901減弱，可能是順鉑進(jìn)入細(xì)胞后形成穩(wěn)定的Pt-DNA加合物，并且順鉑與金屬硫蛋白的穩(wěn)定結(jié)合使細(xì)胞黏附穩(wěn)定、不易軟化、較正常細(xì)胞株不易轉(zhuǎn)移［12］。

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Characteristics of cisplatin resistance in human gastric cancer cell line SGC-7901

Huang Nana，Zhang Yiyin，Gu Kangsheng
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the characteristics of cisplatin resistance in human gastric cancer cell line SGC-7901．Methods Single cell gel electrophoresis（SCGE）was used to measure the level of DNA damage and repair in gastric cancer cell line SGC-7901 and gastric cancer cisplatin resistance cell line SGC-7901／DDP by observing the tail length．Morphological changes of SGC-7901 and SGC-7901／DDP were recorded to evalutate the differences between the two lines．The degree of migration of SGC-7901／DDP and SGC-7901 measured by cell wound scratch assay was used to estimate the ability of invasion．MTT assay was performed to determine the drug sensitivity，IC50values and cross-resistance of SGC-7901／DDP treated with 5-FU，VP-16，ADM，TAX and LOHP separately．Results The level of DNA damage and repair in SGC-7901／DDP was higher than that in SGC-7901 according to the tail length of SCGE tests，suggesting the relationship between cisplatin resistance and the abiity of DNA damage and repair．There was a much smaller volume in SGC-7901／DDP compared with SGC-7901，and clone aggregation always appeared in SGC-7901／DDP．Cell wound scratch assay showed that the migration of SGC-7901／DDP was weaker than that of SGC-7901．MTT showed the significant increase of IC50and cross resitance in SGC-7901／DDP compared with SGC-7901 treated with 5-FU，VP-16，ADM，TAX and LOHP simultaneously．Conclusion The ability of DNA damage and repair in gastric cancer cisplatin resistance cell line SGC-7901 is enhanced significantly．The SGC-7901／DDP shows a notable promotion on multidrug resistance in vivo，and the migration of SGC-7901／DDP is weaker than that of SGC-7901．

gastric cancer；multidrug resistance；cisplatin resistance；SCGE

R 735．2

A

1000－1492（2015）－0298－04

2014－11－24接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MH203）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230022

黃娜娜，女，碩士研究生；顧康生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者；E-mail：gukangsheng12＠163．com