王雅蕊，李 俊，黃 成，李小楓，李曉慧，王 歡

姜黃素對大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF-β調(diào)節(jié)的NADPH氧化酶4的激活及Smad信號通路的影響

王雅蕊1，2，3，李 俊1，2，3，黃 成1，2，3，李小楓1，2，3，李曉慧1，2，3，王 歡1，2，3

目的研究姜黃素潛在的抗纖維化作用，以及轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）激活的機制方法不同濃度的姜黃素（0、5、10、20、40 μmol／L）處理HSC-T6后，用MTT法測定其對HSC-T6增殖作用的影響；用RT-PCR法檢測其mRNA水平的表達；用Westem blot法檢測表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、細(xì)胞外基質(zhì)主要成分α1I膠原（Col1α1）、NADPH氧化酶4（NOX 4）、Smad 2、Smad 3及其磷酸化的水平結(jié)果40 μmol／L的姜黃素組刺激HSC-T6 48 h后，其抑制率達到最大，顯著低于僅TGF-β1刺激組、5、10及20 μmol／L姜黃素組（P＜0．05）。姜黃素可顯著降低激活型HSC-T6的α-SMA、α1I膠原mRNA與蛋白表達，從而可以降低細(xì)胞外基質(zhì)的沉積；有效降低了NOX 4的蛋白水平，減少了活性氧的水平；還明顯降低Smad 2、Smad 3的磷酸化程度，呈濃度依賴性結(jié)論姜黃素在體外能夠明顯地抑制HSC-T6激活，對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有一定抑制作用，其機制可能與抑制TGF-β誘導(dǎo)的NOX4的激活及Smad信號通路有關(guān)。

姜黃素；大鼠肝星狀細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β；NADPH氧化酶4；Smad蛋白

肝纖維化是指各種致病因子所致肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積的一個慢性肝損傷的病理過程。若控制不及時，可最終發(fā)展為肝硬化［1－2］。肝纖維化的標(biāo)志是肝星狀細(xì)胞的活化過程，而轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）通過其下游的Smad等可促進大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCT6）活化、增殖，從而在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的進程中有重要作用［3］。NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX 4）是肝臟中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的一個主要來源。姜黃素是姜黃根莖中的一種黃色成分，具有抗癌、抗氧化和抗感染等特性［4］。研究［5－7］表明，姜黃素有抗肝纖維化作用，但其分子機制仍有待進一步研究。該研究旨在探討姜黃素對TGF-β誘導(dǎo)HSC-T6中NOX 4的激活和Smad表達的影響，對肝纖維化和姜黃素干預(yù)的分子機制的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞由上海中科院細(xì)胞庫提供。細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基（DMEM高糖＋10%胎牛血清＋100 kU／L青霉素＋100 mg／L鏈霉素），在含5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱條件（37℃）下孵育。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1．2 藥品和試劑姜黃素（批號：BCBL0424V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99．8%）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DMSO（美國Sigma公司）；TGF-β（美國R＆D Systems公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；胰蛋白酶、PBS、RIPA強裂解液、PMSF（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；MML-V逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol（日本TaKaRa公司）；100次RT-PCR擴增試劑盒（美國Invitrogen公司）；RT-PCR引物的合成（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；BCA法蛋白濃度定量試劑盒（武漢生物科技有限公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、α1I膠原（collagen type I，Col1α1）、NOX4單克隆抗體（美國Bioworld Technology）；磷酸化Smad 2和Smad 3單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；總Smad 2和Smad 3單克隆抗體（美國Bioworld公司）；β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔和抗鼠IgG（北京中杉金橋公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）。

1．3 主要儀器NAPCO-6100型細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱由美國SHELLAB公司提供；SWCJ-1F型單人雙面超凈工作臺由江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司提供；MLS-3020型自動高壓滅菌鍋由日本Sanyo公司提供；3-16K型高速冷凍離心機由美國Sigma公司提供；PCR梯度擴增儀由德國Eppendoff公司提供；十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）儀由美國BioRad公司提供。

1．4 MTT檢測調(diào)整傳代HSC-T6細(xì)胞懸液濃度，約為1×104個／ml后接種于兩個96孔板中，每孔200 μl細(xì)胞懸液，放于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后除對照組和僅加TGF-β刺激組外，其他加藥組分別加入終濃度各為5、10、20、40 μmol／L的姜黃素，作用30 min后，除對照組外每組加入TGF-β（10 ng／ml）刺激細(xì)胞同時分別培養(yǎng)24 h和48 h，分成6組：對照組，TGF-β刺激組，TGF-β＋5 μmol／L姜黃素組，TGF-β＋10 μmol／L姜黃素組，TGF-β＋20 μmol／L姜黃素組，TGF-β＋40 μmol／L姜黃素組，至作用時間后加入5 mg／ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h。移除上清液，每孔加入DMSO 150 μl，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長490 nm處各孔的吸光度（absorbance，A）值。評估姜黃素對HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制作用。

1．5 RT-PCR檢測按TRIzol試劑說明書提取經(jīng)處理后的HSC-T6總RNA，再立即用紫外分光光度計測定總RNA濃度，測定A260∶A280比值，重復(fù)3次，測得該比值穩(wěn)定于1．8～2．0。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA后進行擴增，以β-actin作為檢測的內(nèi)參物，RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為25 μl，包括cDNA 1 μl，上下游引物各0．5 μl，Mix 12．5 μl，用無酶水補至總體積25 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，總共擴增35個循環(huán)。最終所得的擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。通過光密度掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為目的基因的相對轉(zhuǎn)錄量再進行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列、產(chǎn)物片段長度及反應(yīng)條件見表1。

1．6 Western blot法檢測HSC-T6細(xì)胞用冰冷的RIPA裂解緩沖液加PMSF冰上裂解30 min，收集細(xì)胞裂解物，于4℃、12 000 r／min離心30 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，進行10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，再轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜上，非特異性封閉3 h，加入一抗，4℃過夜。次日含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，后用TBST洗膜4次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光劑進行檢測，曝光、顯影，以β-actin作為內(nèi)參，分別以目的蛋白與β-actin光密度比值作為該目的蛋白的相對表達量。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析、t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0．05，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2．1 姜黃素對TGF-β誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測顯示，與對照組相比，經(jīng)TGF-β 10 ng／ml刺激后，HSC-T6細(xì)胞的增殖活性明顯增強；與TGF-β刺激組相比，姜黃素組HSC-T6增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P24h＜0．05、0．01，F(xiàn)＝37．318），（P48h＜0．01，F(xiàn)＝165．123），且呈濃度相關(guān)性，當(dāng)濃度達到40 μmol／L時抗增殖作用非常顯著。見圖1。

2．2 姜黃素對TGF-β刺激HSC-T6的激活及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。與未處理的對照組相比，經(jīng)TGF-β 10 ng／ml刺激后α-SMA和α1I膠原mRNA明顯增高；與TGF-β刺激組相比，TGF-β加不同濃度姜黃素組通過減少α-SMA mRNA與α1I膠原mRNA水平的表達，從而減少了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01，F(xiàn)＝58．102；P＜0．01，F(xiàn)＝315．856）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，HSC-T6細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后，α-SMA和α1I膠原表達均有不同程度的下降，且呈濃度相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01，F(xiàn)＝356．227；P＜0．01，F(xiàn)＝28．952），見圖3。

2．3 姜黃素對TGF-β誘導(dǎo)的NOX4表達的影響

NOX4的蛋白水平在激活的HSC-T6（TGF-β刺激組）中上調(diào)。而經(jīng)不同濃度的姜黃素處理后，明顯稀釋了TGF-β誘導(dǎo)的NOX 4的上調(diào)作用，而且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01，F(xiàn)＝30．888），見圖4。

2．4 姜黃素對TGF-β誘導(dǎo)的Smad表達的影響Western blot法實驗結(jié)果表明，HSC-T6細(xì)胞經(jīng)TGF-β（10 ng／ml）作用24 h后，與對照組相比，Smad磷酸化水平phospho-Smad 2（p-Smad 2）、phospho-Smad 3（p-Smad3）明顯上調(diào)，但經(jīng)和姜黃素一起作用后，與僅TGF-β 10 ng／ml相比，Smad2的磷酸化水平逐步下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01，F(xiàn)＝72．400），而且Smad3的磷酸化水平也逐步下降（P＜0．01，F(xiàn)＝13．303），見圖5。Smad 2和Smad 3蛋白本身無顯著變化。

3 討論

多個復(fù)雜信號通路，包括氧化應(yīng)激和Smad信號，參與TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6激活。氧化應(yīng)激在各種疾病中起著重要作用，通過超氧化物和過氧化氫的形式產(chǎn)生活性氧。之前的研究［8］表明，氧化應(yīng)激在各種細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的各種細(xì)胞反應(yīng)。而在HSC-T6中，氧化應(yīng)激的主要來源來自NADPH氧化酶；是一個由多種亞單位組成的，含有6個α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域的酶復(fù)合體。NADPH氧化酶家族包括7個成員，其中，NOX 4在HSC-T6表達并通過特定的細(xì)胞內(nèi)信號使HSCs活化，從而促進肝纖維化形成。因此，通過阻斷NOX 4產(chǎn)生ROS，可能會阻止肝纖維化形成。

目前，許多研究［9］表明，TGF-β是肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵因子。因此，TGF-β信號級聯(lián)就成為了研究種種致病因子所導(dǎo)致肝臟病變的潛在目標(biāo)。TGF-β結(jié)合其受體后激活，其信號傳遞需要一系列受體后信號分子。之前有研究［10］表明，Smad蛋白是TGF-β受體作用的胞內(nèi)激酶底物，有效地介導(dǎo)了TGF-β在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad家族蛋白由受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白（Smad 2、Smad 3）、共同調(diào)節(jié)型Smad蛋白（Smad 4）和抑制型Smad蛋白（Smad 6、Smad 7）3類組成。TGF-β刺激激活其受體，作用于胞質(zhì)內(nèi)下游分子，激活的Smad 2、Smad 3與Smad 4形成異源寡聚物，將TGF-β信號從胞質(zhì)移到細(xì)胞核中，同時招募其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β／Smads是經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本過程為：TGF-β首先在細(xì)胞外與細(xì)胞膜表面TβRⅡ結(jié)合，同時激活TβRⅠ，作用于下游因子，使Smad 2／3磷酸化，Smad 2／3激活與Smad 4形成R-Smad-Smad 4復(fù)合物進入胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［11］。因此，本實驗通過檢測p-Smad 2／3水平作為TGF-β信號通路的激活水平和強度。在慢性肝損傷的情況下，通過TGF-β／Smad信號通路激活HSC-T6，導(dǎo)致HSC-T6活化增殖，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，刺激ECM的合成，而且增加金屬蛋白酶組織抑制因子表達，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)ECM降解，使ECM降解和合成嚴(yán)重失衡，ECM沉積過度，促進肝纖維化的進展［12］。

既往研究［13］結(jié)果顯示，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗感染及抗腫瘤等作用。但是，姜黃素的作用分子機制復(fù)雜，可能有各種信號分子參與。本實驗將培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞為研究對象，在體外TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞NOX4的表達和Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路姜黃素的干預(yù)作用，進一步探討姜黃素防治肝纖維化的作用機制。本研究顯示，NOX4蛋白表達在TGF-β刺激下上調(diào)，而姜黃素劑量依賴性地降低其上調(diào)作用，由此得出姜黃素在HSCs中通過改變NOX4的表達從而調(diào)控ROS信號。相似地，HSC-T6細(xì)胞經(jīng)TGF-β（10 ng／ml）作用24 h后，與對照組相對比，Smad2、Smad3的磷酸化水平顯著增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)果說明，TGF-β過表達激活了Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使R-Smad（Smad2、3）表達增強，進而使信號得以傳遞。但經(jīng)姜黃素干預(yù)后，Smad2、3的磷酸化程度受到抑制，與僅TGF-β刺激組相比有顯著性差異。說明姜黃素具有下調(diào)NOX4及Smad 2、Smad 3的表達，并抑制TGF-β／Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進一步揭示了肝纖維化的預(yù)防和治療的機制。

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Curcumin attenuates hepatic fibrogenesis through interrupting TGF-β-mediated NADPH oxidase 4 activation and Smad signaling in vitro

Wang Yarui1，2，3，Li Jun1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，Anhui Medical University，Hefei 230032；3Institute for Innovative Drug Industrial Generic Technology Research of Anhui，Hefei 230032）

ObjectiveTo observe the effects of curcumin on activation and proliferation of hepatic stellate cells（HSCs）and，their expression of NADPH oxidase 4（NOX 4）and smad signaling factors of rat hepatic stellate cells line in vitro using a rat HSC line．Methods Synchronized HSC-T6 cells were treated with different dose of purified curcumin（0，5，10，20，40 μmol／L）．Untreated cells were viewed as controls．MTT technique analysis was used to examine the proliferation of the hepatic stellate cells stimulated by differernt concentration of curcumin；the mRNA expression of α-smooth muscle actin（α-SMA）and main constituents in extracellular matrix I procollagen（α1I collagen）were determined by RT-PCR in TGF-β-stimulated HSCs，and the antifibrotic effects on the protein expression of α-SMA，α1I collagen，NADPH oxidase（NOX）protein（NOX 4）and the phosphorylation level of smad 2 and smad 3 was assessd by western blot；beta-actin（β-actin）was detected as the normalization control in the hepatic smllate cells was examined by Western blot analysis．Results The inhibition rate of HSC-T6 cells was the largest with curcumin for 48 h，significantly lower than that of TGF-β-stimulated group，5 μmol／L，10 μmol／L and 20 μmol／L group（P＜0．05）．Notably，curcumin could obviously reduce the expression of α-SMA and α1I collagen at both mRNA and protein levels and reduce the deposition of extracellular matrix．Treatment of curcumin markedly blocks up-regulation of NOX4 by TGF-β．It also significantly reduced TGF-β-induced Smad 2／3 phosphorylation，and this effect observed dose-dependent．Conclusion Curcumin inhibited TGF-β-mediated HSC activation in vitro，which was involved in Smad signaling pathway，and consequently influenced the profibrotic actions of TGF-β on HSC-T6 cells．Our results suggest that curcumin could become potential candidate for the therapeutic applications by inhibiting the TGF-β induced NOX activation and Smad signaling．

curcumin；rat hepatic stellate cell；transforming growth factor-β；NADPH oxidase 4；drosophila mothers against decapentaplegic protein

R 962．1；R 967

A

1000－1492（2015）03－0319－05

2014－11－12接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81273526）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院、2肝病研究所，合肥 230032

3安徽創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究所，合肥 230032

王雅蕊，女，碩士研究生；李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj＠ahmu．edu．cn