方 瑜，王 琳，李桂梅，張 瑜，楊寧蓉，秦叔逵

c-Met、VEGF在AFP陽性胃癌中的表達(dá)及意義

方 瑜1，王 琳1，李桂梅2，張 瑜1，楊寧蓉1，秦叔逵1

目的探討肝細(xì)胞生長因子受體c（c-Met）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在甲胎蛋白（AFP）陽性胃癌中的表達(dá)，并探討c-Met、VEGF與AFP陽性胃癌臨床病理特征的關(guān)系方法收集臨床上AFP陽性胃癌組織標(biāo)本共21例作為試驗(yàn)組，同時(shí)收集與該21例AFP陽性胃癌臨床分期基本一致的普通胃癌組織標(biāo)本作為對(duì)照組，通過免疫組織化學(xué)法檢測其c-Met、VEGF的表達(dá)，分析比較兩組腫瘤c-Met、VEGF表達(dá)的差別結(jié)果試驗(yàn)組與對(duì)照組c-Met蛋白的陽性表達(dá)率分別為85．7%（18／21）、71．4%（15／21）；VEGF蛋白的陽性表達(dá)率分別為76．2%（16／21）、47．6%（10／21）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在VEGF、c-Met蛋白的表達(dá)上明顯高于后者（P＜0．05）。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示c-Met與VEGF在試驗(yàn)組中表達(dá)呈正相關(guān)（rs＝0．621，P＜0．05）。根據(jù)Lauren分型，發(fā)現(xiàn)在AFP陽性胃癌中腸型胃癌較其他類型易表達(dá)c-Met。未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組中c-Met、VEGF表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間、AFP水平等臨床病理特征有相關(guān)性結(jié)論試驗(yàn)組中c-Met及VEGF表達(dá)顯著高于對(duì)照組，可能共同參與了AFP陽性胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并可能具有協(xié)同促腫瘤血管生成作用。

胃癌；甲胎蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；c-Met

甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）一度被認(rèn)為是肝癌及惡性生殖細(xì)胞腫瘤的特異性腫瘤標(biāo)志物。Bourreille et al［1］在1970年首次報(bào)道了1例AFP陽性胃癌（alpha-fetoprotein-producing gastric carcinoma，AFPGC）。自此，人們逐漸認(rèn)識(shí)到胃腸癌、胰腺癌、膽囊癌、肺癌、乳腺癌等均可不同程度產(chǎn)生AFP，其中以胃癌產(chǎn)生AFP率最高，國外文獻(xiàn)［2］報(bào)道約占胃癌的1．3%～15．0%。AFPGC整體預(yù)后較普通胃癌差，易發(fā)生淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)AFPGC的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制尚不甚了解。而肝細(xì)胞生長因子受體c（c-Met）與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的主要分子標(biāo)志物之一，且臨床上已有針對(duì)該標(biāo)志物的靶向藥物。故該研究利用免疫組化法檢測21例AFPGC和普通胃癌中c-Met、VEGF蛋白表達(dá)的情況，旨在探討兩者之間的相關(guān)性及其在AFPGC臨床病理特征和判斷預(yù)后中的意義。

1 材料與方法

1．1 病例資料收集南京解放軍八一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2012年6月～2014年6月手術(shù)切除標(biāo)本或胃鏡活檢組織蠟塊存檔，其中AFPGC（即經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的胃癌，伴有血清AFP升高（≥10 μg／L），并排除肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌及生殖細(xì)胞惡性腫瘤等其他可能產(chǎn)生AFP的疾?。?1例作為試驗(yàn)組。根據(jù)AJCC第7版TNM分期，其中Ⅲ期2例，Ⅳ期19例，男18例，女3例，年齡21～83（58．5±17．3）歲。AFPGC組織學(xué)亞型［3］組成：肝樣型2例、胎兒胃腸型或普通型19例。另外，選取臨床分期基本一致的普通胃癌（血清AFP＜10 μg／L）組織蠟塊21例作為對(duì)照組，其中男14例，女7例，年齡29～78（53．8± 11．0）歲。兩組間年齡及性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)獲所有患者或家屬知情同意。即用型兔抗人Met單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、免疫組化試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 免疫組化檢測 按試劑盒說明書操作。采用免疫組織化學(xué)法。選擇研究石蠟標(biāo)本，3～4 μm切片，60℃過夜。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。檸檬酸（pH 6．0）微波抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照：以已知陽性切片重復(fù)染色為陽性對(duì)照：以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1．2．2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) c-Met蛋白免疫組化染色陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色顆粒；VEGF蛋白免疫組化染色陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。按陽性著色程度評(píng)分：0分為無著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。按陽性細(xì)胞的比例評(píng)分：每張切片隨機(jī)觀察4個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比值，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。綜合兩種評(píng)分，取分值較少的作為最終判定結(jié)果：0分為陰性（－），1分為弱陽性（＋），2分為陽性（＋＋），3分為強(qiáng)陽性（＋＋＋）結(jié)果由2名病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀，對(duì)判讀不一致的病例取平均值或協(xié)商決定。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行分析，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U Test）比較兩組胃癌c-Met及VEGF表達(dá)差異；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析c-Met與VEGF間的相關(guān)性；采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法對(duì)c-Met、VEGF表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系以及兩組胃癌性別、年齡的組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)；對(duì)于不同Lauren分型與c-Met、VEGF表達(dá)的差異采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和兩兩比較的秩和檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)）法。

2 結(jié)果

2．1 試驗(yàn)組與對(duì)照組中c-Met和VEGF蛋白的表達(dá)c-Met蛋白在癌組織中陽性染色主要定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色或棕褐色顆粒（圖1A）；VEGF蛋白在癌組織中陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒（圖1B）。c-Met蛋白在試驗(yàn)組與對(duì)照組中陽性表達(dá)率為85．7%（18／21）、71．4%（15／21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；VEGF蛋白在試驗(yàn)組與對(duì)照組中陽性表達(dá)率為76．2%（16／21）、47．6%（10／21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1。

2．2 c-Met和VEGF蛋白在AFPGC組織中表達(dá)的相關(guān)性c-Met、VEGF在AFPGC中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（rs＝0．621，P＜0．05），見表2。

2．3 c-Met和VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系經(jīng)χ2和Fisher確切概率法檢驗(yàn)，AFPGC組織中c-Met、VEGF表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、Lauren分型、總生存時(shí)間、AFP水平等無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。隨后將c-Met、VEGF表達(dá)情況與Lauren分型的關(guān)系進(jìn)一步分析，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和兩兩比較的秩和檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)）法比較不同Lauren分型與c-Met、VEGF表達(dá)是否有差異。c-Met表達(dá)與Lauren分型有關(guān)（P＜0．05）。在腸型AFPGC中表達(dá)顯著高于彌漫型（t＝3．97，P＜0．05）及混合型（t＝2．82，P＜0．05）。而VEGF表達(dá)與Lauren分型無明顯相關(guān)性。見表4。

3 討論

AFPGC不同于普通胃癌，其惡性度高、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，被認(rèn)為是一種特殊類型的胃癌。目前AFPGC的治療更多的是借鑒普通胃癌，但療效遜于普通胃癌。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向藥物應(yīng)用于臨床，研究者們逐漸將精力集中在研究不同腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)的差異上，期望在分子水平探討腫瘤之間的差異。對(duì)于AFPGC與普通胃癌之間也是如此。

c-Met蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是由原癌基因c-Met編碼表達(dá)的一種膜受體，被認(rèn)為是肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的唯一受體。c-Met與HGF結(jié)合并呈現(xiàn)高水平的二聚化和自體磷酸化，從而激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的生長、擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)、侵襲、抑制細(xì)胞凋亡和血管生成等。此外，c-Met還可以不依賴HGF而被激活，Met蛋白的高表達(dá)可能是由于c-Met基因的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或轉(zhuǎn)錄后機(jī)制造成。研究［4］顯示許多腫瘤細(xì)胞中c-Met過度表達(dá)。在肺癌治療中發(fā)現(xiàn)Met基因擴(kuò)增與分子靶向藥物的耐藥性相關(guān)［5］。孫燕來等［6］發(fā)現(xiàn)HGF及c-Met可能與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)?？梢奵-Met的臨床價(jià)值潛力巨大。本實(shí)驗(yàn)顯示c-Met在AFPGC中表達(dá)顯著高于普通胃癌，與國外研究［7］結(jié)果基本一致?？赡苡捎跇颖玖枯^少，僅顯示c-Met表達(dá)與Lauren分型有關(guān)，而未表明其與患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間、AFP水平等因素相關(guān)。Lauren分型中腸型AFPGC易表達(dá)c-Met。早前研究［8］就表明c-Met基因在腸型胃癌中的變化是以擴(kuò)增和過表達(dá)為主，腸化及不典型增生胃黏膜c-Met基因過表達(dá)呈高水平，與胃黏膜癌變過程的發(fā)生和發(fā)展是密切相關(guān)的。c-Met是否與不同Lauren分型預(yù)后不同有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

VEGF是目前已知作用最強(qiáng)、專屬性最高的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促血管生成因子。AFPGC細(xì)胞易表達(dá)VEGF，彌海寧等［9］發(fā)現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)率在AFPGC組織中為90．5%（19／21），AFP陰性胃癌組織中為67．2%（162／241），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kamei et al［10］研究表明AFPGC易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與AFPGC組織中VEGF，尤其是VEGF-C表達(dá)明顯升高有關(guān)，并與AFP水平呈正相關(guān)。本研究亦顯示VEGF在AFPGC中表達(dá)高于普通胃癌，但未能證明VEGF與AFPGC臨床病理特征之間的關(guān)系。

在AFPGC組織中，c-Met表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)文獻(xiàn)［11］也表明HGF與其受體c-Met結(jié)合可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，而VEGF為主要的促血管生成因子，故c-Met和VEGF可能在促進(jìn)新生血管形成方面具有協(xié)同作用。

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The expression and significance of c-Met，VEGF in the AFP-positive gastric cancer

Fang Yu1，Wang Lin1，Li Guimei2，et al
（1Dept of Medical Oncology，2Dept of Pathology，Anhui Medical University Affiliated 81 Hospital of PLA，Nanjing 210002）

ObjectiveTo investigate the expression of c-Met and vascular endothelial growth factor（VEGF）in the alpha fetoprotein（AFP）-positive gastric cancer，and to explore the relationship between expression of c-Met and VEGF with clinicopathological features of AFP-positive gastric cancer．Methods A total of 21 cases AFP-positive gastric cancer tissues were selected as a test group，while collected 21 cases ordinary gastric，which had consistency with AFP-positive gastric cancer in stage，as a control group．The expressions of c-Met and VEGF were detected by immunohistochemistry，then the differences of c-Met，VEGF expression in two kinds of tumor were analyzed and compared．Results The positive expression rates of c-Met protein in AFP-positive gastric cancer and ordinary gastric carcinoma were 85．7%（18／21）and 71．4%（15／21），respectively．The positive expression rates of VEGF protein were 76．2%（16／21）and 47．6%（10／21），respectively．Compared with ordinary gastric cancer，AFP-positive gastric cancer was significantly higher than the former in the expression of VEGF and c-Met protein（P＜0．05）．Spearman rank correlation analysis showed that c-Met and VEGF expressions were positively correlated（rs＝0．621，P＜0．05）in the AFP-positive gastric carcinoma．AFP-positive gastric cancer，which was intestinal type by the Lauren classification，was more likely to express c-Met．The expressions of c-Met and VEGF were not siginificantly associated with the clinicopathological features in AFP-positive gastric cancer，such as age，sex，tumor location，degree of differentiation，lymph node metastasis，liver metastasis，survival time and AFP levels．Conclusion The expressions of c-Met and VEGF in AFP-positive gastric cancer tissues are significantly higher than ordinary gastric cancer tissues．They may be involved in the occurrence and development of AFP-positive gastric cancer and have synergistic effect on pro-angiogenesis．

gastric cancer；alpha-fetoprotein；VEGF；c-Met

R 735．2

A

1000－1492（2015）03－0357－04

2014－10－23接收

中國胃腸腫瘤臨床研究協(xié)作組（CGOG）胃癌研究基金（編號(hào)：20130101002）

安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍八一臨床學(xué)院1全軍腫瘤中心腫瘤內(nèi)科、2病理科，南京 210002

方 瑜，男，碩士研究生；王 琳，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wanglin81yy＠163．com