劉榕 陰懷清

[摘要] 高膽紅素血癥可導(dǎo)致神經(jīng)細胞的壞死或凋亡，最終引起不同程度的腦損傷。目前對凋亡的研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)Caspase-3在誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制中有重要作用。神經(jīng)生長因子是第一個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，眾多研究表明：顱腦損傷后神經(jīng)生長因子可保護受損的神經(jīng)元，促進軸突定向再生，增加乙酰膽堿表達，改善膽堿能神經(jīng)元功能，提高腦灌注，從而改善腦功能。本文主要對Caspase-3與神經(jīng)生長因子在高膽紅素血癥腦損傷中的影響進行綜述。

[關(guān)鍵詞] 高膽紅素血癥；細胞凋亡；Caspase；神經(jīng)生長因子

[中圖分類號] R722.17 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）31-0157-04

Study on Caspase-3 and nerve growth factor in brain injury in hyperbilirubinemia

LIU Rong1 YIN Huaiqing2

1.Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Pediatrics，the Affiliated First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， China

[Abstract] Hyperbilirubinemia can lead to neuronal cell necrosis or apoptosis，resulting in varying degrees of brain damage.At present，in the process of study on apoptosis，people found that Caspase-3 plays a key role in the molecular mechanism of inducing cell apoptosis.Nerve growth factor is the first discovered neurotrophic factor，numerous studies show that：after brain injury，nerve growth factor can protect damaged neurons，promote axon directed regeneration，increase the expression of acetylcholine，improve the function of cholinergic neurons and improve brain perfusion，thereby improving brain function.This article mainly reviewed the influence of Caspase-3 and nerve growth factor on brain injury in hyperbilirubinemia.

[Key words] Hyperbilirubinemia； Apoptosis； Caspase； Nerve growth factor

新生兒高膽紅素血癥是新生兒期最常見的問題，也是新生兒住院的主要原因之一，近年來發(fā)病率逐步上升，現(xiàn)高達30%～50%[1]。如治療不當(dāng)可引發(fā)膽紅素腦病，即核黃疸（kernicterus），導(dǎo)致不同程度的腦損傷，輕則會導(dǎo)致遠期智商、情商低下、聽力損傷等，重則會造成新生兒死亡。有報道稱，約2/3存活患兒可遺留永久的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]，對新生兒的健康造成極大威脅。因此，深入研究高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)病機制及防治措施，對其發(fā)病率的控制有重要意義。本文就Caspase-3與神經(jīng)生長因子的結(jié)構(gòu)、功能及其在高膽紅素血癥腦損傷中的作用進行綜述，有助于高膽紅素血癥腦損傷的研究。

1 Caspase-3與高膽紅素血癥腦損傷

1.1 Caspase

Caspase是在對哺乳動物細胞的凋亡進行研究時，人們發(fā)現(xiàn)的一組ICE（interleukin-1β convert enzyme，即Caspase-1）類蛋白，是一組半胱氨酸蛋白酶[3]，在細胞凋亡過程中有著關(guān)鍵作用，有以下共同點：①與Caspase-1有同源性；②其氨基端的一段序列被水解后可激活以無活性的酶原形式存在的底物；③底物中存在的天冬氨酸羧基端肽鍵在催化時斷裂[4]；④有高度保守五肽序列[5]；⑤Caspase被水解后可產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)；⑥Caspase家族一般有抑制劑[6，7]。目前至少16種Caspase在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)的先后順序命名為Caspase-1～Caspase-16[6]。

1.2 Caspase-3與細胞凋亡

迄今為止，研究比較透徹的是作為主要的效應(yīng)者分子的Caspass-3。人Capsape-3基因定位于染色體4q33-q35處。目前眾多研究表明，在哺乳動物細胞凋亡中Caspase-3是關(guān)鍵蛋白酶，且Caspase-3活化后可通過3種途徑導(dǎo)致細胞解體[8]：①裂解胞內(nèi)的骨架蛋白和胞外的細胞外基質(zhì)，如肌動蛋白、角質(zhì)蛋白等。②裂解凋亡抑制物，如核酸內(nèi)切酶抑制劑（ICAD/DFF45）、Bcl-2等。③DNA修復(fù)相關(guān)分子的裂解，如DNA依賴性蛋白激酶。

底物被酶解失活后會導(dǎo)致細胞的形態(tài)、功能發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為細胞皺縮，胞質(zhì)致密，核染色質(zhì)邊集，而后胞核裂解，胞質(zhì)生出芽突并脫落，形成核碎片和（或）細胞器成分的膜包被小體，即凋亡小體。凋亡現(xiàn)象在本質(zhì)上是一系列Caspase的級聯(lián)切割過程。

1.3 高膽紅素血癥腦損傷機制

膽紅素可引起神經(jīng)細胞凋亡增加，已在體內(nèi)外實驗中得到肯定，但引起凋亡的具體發(fā)病機制仍不清楚，其可能機制如下：

1.3.1 Ca2+超載 各種原因引起的細胞內(nèi)鈣含量異常增多并導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙的現(xiàn)象稱為鈣超載。眾多研究表明[9，10]，胞質(zhì)中Ca2+濃度的升高與細胞凋亡（apoptosis，AP）之間存在著密切的聯(lián)系。膽紅素進入腦組織后可能通過影響細胞膜對鈣離子的通透性，影響膜上鈣泵的活性等使細胞內(nèi)形成鈣超載現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細胞凋亡。

1.3.2 影響線粒體呼吸功能 線粒體中有許多非常重要的蛋白酶或蛋白質(zhì)，它們與細胞凋亡直接相關(guān)，如凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）、細胞色素C[11]、Bcl-2家族成員、半胱氨酸水解酶[12]等，它是真核細胞的動力加工廠，在介導(dǎo)細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。Schif等通過實驗發(fā)現(xiàn)細胞中膽紅素發(fā)揮其毒性作用的最初部位是線粒體。50年代，Zeterstron和Ernster發(fā)現(xiàn)，能達到抑制小鼠肝、腦細胞線粒體的磷酸化及生物氧化作用的膽紅素濃度是300M。Rodrigues等[13]通過實驗證實解離線粒體氧化磷酸化是膽紅素的主要毒性作用，膽紅素可改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細胞色素C釋放，再作用于一些激酶和水解酶，啟動神經(jīng)細胞凋亡。

因此，膽紅素通過造成胞內(nèi)Ca2+超載，影響線粒體的呼吸功能從而造成神經(jīng)細胞的凋亡[14]。動物實驗結(jié)果顯示：高膽紅素血癥可誘導(dǎo)模型鼠腦組織Caspase-3表達增加，Caspase-3的表達在造模后24 h后出現(xiàn)高峰，表明過多的Caspase-3參與了高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)生[15]，但在此分子鏈中具體的信號傳導(dǎo)機制及過程尚未完全闡明。

2 神經(jīng)生長因子及其對中樞神經(jīng)損傷的保護作用

2.1神經(jīng)生長因子簡介

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是第一個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，目前為人們所熟悉的經(jīng)典的NGF是從小鼠頜下腺分離所得，其相對分子質(zhì)量為140×103，是一種蛋白質(zhì)，由118個氨基酸組成，由以非共價鍵結(jié)合的一個β亞單位、兩個α亞單位及兩個γ亞單位組成，其分子組成中含有2個鋅原子，增加了分子的穩(wěn)定性，其中有活性的亞基是β亞單位[16，17]。目前，人類NGF的基因序列已經(jīng)明確，研究表明：人類NGF與小鼠NGF有90%的同源性[18]。NGF通過與其受體的結(jié)合發(fā)揮作用，哺乳動物中存在兩種可與NGF結(jié)合的跨膜受體，即高親和力受體酪氨酸激酶受體（TrkA）和低親和力受體p75NTR。當(dāng)TrkA和p75NTR共同存在時，p75NTR可通過增加TrkA與NGF的親和力促進神經(jīng)細胞軸突的生長，但當(dāng)p75NTR單獨存在時，則會介導(dǎo)細胞的凋亡[19]。

2.2 NGF對中樞神經(jīng)損傷的保護作用

顱腦損傷后，應(yīng)用外源性NGF可促進神經(jīng)纖維再生，誘導(dǎo)軸突定向生長，修復(fù)受損的神經(jīng)元。黃莉等[20]通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，應(yīng)用外源性NGF對其進行干預(yù)，證實新生大鼠缺氧缺血后，NGF可使其皮質(zhì)和海馬部位的神經(jīng)細胞凋亡明顯減輕，腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)改變均減輕。龍琦等[21]用神經(jīng)生長因子（NGF）、外源性堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）及二者聯(lián)合用藥分別對缺氧缺血腦損傷（HIBD）新生大鼠進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，NGF、bFGF均可提高HIBD后海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量；而二者聯(lián)合應(yīng)用則可明顯提高神經(jīng)元的數(shù)量?？紫槊返萚22]的進一步研究中，先用谷氨酸造成體外培養(yǎng)的大腦基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷，再用NGF干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF保護組大腦基底神經(jīng)節(jié)GAP-43mRNA和NF-L表達較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)正?；顒铀匦璧妮S漿運輸中有重要作用，而軸漿運輸與神經(jīng)再生及損傷后修復(fù)有密切關(guān)系，表明NGF可促進神經(jīng)元再生。同時，Ziemba等[23]的研究移植神經(jīng)定向生長的實驗中，將載有神經(jīng)生長因子基因序列的病毒載體植入特定區(qū)域，發(fā)現(xiàn)隨著NGF的表達，植入大鼠胼胝體處的背根神經(jīng)元有向高濃度NGF區(qū)域生長的趨勢。Jin Y等[24]也證實在顱腦損傷時，通過復(fù)合介導(dǎo)途徑，NGF可使軸突通過損傷區(qū)生長。以上研究證實了NGF的神經(jīng)元保護作用，其具體機制可能如下：

2.2.1 拮抗自由基作用 神經(jīng)細胞內(nèi)含有許多自由基清除劑，如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，顱腦損傷致白細胞活化后會釋放一些對細胞有害的細胞因子，如IL-6和氧自由基等，而這些有害的細胞因子反過來又會加重腦損傷。周政等[25]用NGF對大鼠轉(zhuǎn)基因后研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NGF轉(zhuǎn)基因大鼠發(fā)生短暫腦缺血損傷后，其腦皮質(zhì)、海馬區(qū)中神經(jīng)細胞的凋亡明顯減少，而一些自由基清除劑如銅鋅超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的含量明顯增高。也有實驗證明[26]：NGF可通過增加自由基清除劑的活性，減輕顱腦損傷時神經(jīng)元的凋亡。

2.2.2 細胞內(nèi)ca2+水平的穩(wěn)定 腦缺血腦損傷后，通過促進氧自由基生成、加重酸中毒、破壞細胞膜等途徑可使細胞內(nèi)形成Ca2+超載現(xiàn)象，從而引起神經(jīng)元的壞死或凋亡。有研究表明[27]：離體細胞在外源性H2O2存在時，胞內(nèi)Ca2+會明顯增加，而（1～100）μg/L的NGF可抑制低濃度H2O2（0.05 mmol/L）引起的Ca2+升高，且呈劑量依賴性，提示NGF通過穩(wěn)定細胞內(nèi)Ca2+的水平來保護損傷神經(jīng)元。Cheng等[28]認為其原因可能是NGF增強細胞排出及緩沖Ca2+的能力，提示NGF能通過影響那些調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流的蛋白質(zhì)（如谷氨酸受體、電壓依賴Ca2+通道、Na+和K+通道等）的表達及功能，發(fā)揮其對神經(jīng)元的保護作用。

2.2.3 拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性 興奮性氨基酸中與缺血性腦損傷有關(guān)的主要是谷氨酸，正常情況下參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，但過量的谷氨酸會損傷神經(jīng)元。當(dāng)谷氨酸濃度升高時，通過NMDA信號傳導(dǎo)途徑使細胞內(nèi)形成Ca2+超載現(xiàn)象，進而導(dǎo)致細胞凋亡[29]。王艷輝等[30]的實驗證明：與興奮性氨基酸毒性作用有關(guān)的小腦細胞凋亡，可被濃度為50 μg/L、l00 μg/L的NGF緩解，因某些單核細胞能夠分泌NFG。Zassler等[31]將這類單核細胞移植入模型動物體內(nèi)后，研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，移植組中通過NMDA途徑導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯減少，表明NGF可通過拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性實現(xiàn)對神經(jīng)元的保護。

3 Caspase-3與NGF中樞神經(jīng)元保護作用的相關(guān)性

我們知道，發(fā)生高膽紅素血癥腦損傷時，可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，Caspase-3是Caspase家族中與細胞凋亡關(guān)系最密切的，并在其中發(fā)揮著重要作用，而NGF對受損的中樞神經(jīng)元有明確的保護作用，為了研究中樞神經(jīng)損傷時受到NGF干預(yù)后腦組織中Caspase-3的表達變化，人們進行了大量實驗。葛洪亮等[32]在大鼠脊髓損傷后用蛇毒神經(jīng)生長因子進行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干預(yù)組損傷脊髓組織中 Caspase-3蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。張彥等[33]用神經(jīng)生長因子對紅藻氨酸（KA）致癲癇大鼠進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF能有效抑制其海馬區(qū)Caspase-3的表達，發(fā)揮其腦損傷保護作用。有實驗表明[34]，大鼠腦缺血再灌注后，腦內(nèi)Caspase-3表達增多，并于再灌注后24 h達到高峰，與對照組相比，Caspase-3在NGF干預(yù)組腦組織中表達減少。也有研究表明[35]，NGF可通過下調(diào)c-jun mRNA及Caspase-3蛋白的表達，減少缺血神經(jīng)元的凋亡。也有人用神經(jīng)生長因子、外源性降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）以及二者聯(lián)合分別對短暫性全腦缺血后再灌注大鼠進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF和CGRP均可抑制全腦缺血后大鼠紋皮質(zhì)Caspase-3蛋白表達，聯(lián)合應(yīng)用則能顯著抑制Caspase-3表達，提示NGF和CGRP通過抑制Caspase-3蛋白表達對缺血神經(jīng)元起保護作用，且二者對保護缺血神經(jīng)元可能有協(xié)同作用[36]。

以上結(jié)論表明：NGF可通過抑制Caspase-3的表達實現(xiàn)對神經(jīng)元的保護，但NGF如何對Caspase-3進行作用尚不完全清楚，可能與NGF的拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、穩(wěn)定細胞內(nèi)Ca2+水平及增加自由基清除劑的活性等作用有關(guān)?？梢圆孪?，在高膽紅素血癥腦損傷致細胞凋亡的過程中，有Caspase-3的參與，如果用外源性NGF進行干預(yù)，有可能降低腦組織中Caspase-3蛋白的表達，從而延緩甚至阻斷高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)展，而有關(guān)NGF如何影響高膽紅素血癥腦損傷腦組織中Caspase-3表達的報道目前仍比較少，這些都有待進一步研究。

4 前景及展望

近年來，高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程及其防治措施逐漸成為研究熱點，但相關(guān)報道目前仍比較少。眾多體內(nèi)外實驗表明，過量膽紅素可加速神經(jīng)細胞凋亡，且Caspase-3在其中有關(guān)鍵作用，但具體的分子機制并不清楚，而NGF的神經(jīng)元保護作用雖然明確，但其分子機制尚未完全闡明，尤其是在高膽紅素血癥腦損傷中，NGF對損傷腦組織中Caspase-3表達的影響及其作用機制仍需進一步研究。因此，高膽紅素血癥腦損傷后腦組織中Caspase-3的表達變化研究及神經(jīng)生長因子的神經(jīng)元保護機制研究，有助于對高膽紅素血癥腦損傷發(fā)生發(fā)展過程的進一步認識，有望探索出一條可行的高效準確的干預(yù)通路，以盡可能減輕過量膽紅素造成的腦損傷，甚至一定程度上阻止高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)展。

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（收稿日期：2015-09-15）