黃麗萍，黃麗英，林守二，俞曉玲

金線蓮（Anoectochilusroxburghii，A.roxburghii）系蘭科開(kāi)唇蘭屬草本植物，主要分布于亞洲的中國(guó)、日本、斯里蘭卡和印度等國(guó)，在中國(guó)以福建、浙江為主產(chǎn)地，素有“神藥”、“金草”、“藥王”等美稱(chēng)，具有清熱涼血解毒、固腎平肝、降血糖、降血壓和消炎等功效，民間多用于治療糖尿病、高血壓、乙型肝炎等疾病[1－7]。據(jù)報(bào)道，金線蓮中含有甾體化合物、糖苷類(lèi)化合物、有機(jī)酸、黃酮類(lèi)及黃酮苷類(lèi)化合物、生物堿和核苷類(lèi)物質(zhì)等[8－14]。

黃酮類(lèi)化合物廣泛分布于植物界中，是許多中藥的有效成分，具有抗菌消炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、防治高血壓及腦出血等多方面的生物活性[15]。異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素是中藥中常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物[15]，其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷具有強(qiáng)烈的刺激動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生前列環(huán)素和組織多肽抗原（tissue polypeptide antigen，tPA）的活性，同時(shí)對(duì)家兔體內(nèi)、外血小板聚集功能有明顯的抑制作用[16]；異槲皮苷具有一定的抗氧化、抗腫瘤和抗血小板凝集作用及抗抑郁作用[17－18]；槲皮素具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護(hù)作用等[19]；異鼠李素具有止咳祛痰、消食化滯和活血散瘀等作用[20]。

筆者應(yīng)用反相高效液相色譜（reverse phasehigh performance liquid chromatography，RP－HPLC）法梯度洗脫測(cè)定金線蓮中上述的4種具有重要藥理活性的黃酮類(lèi)物質(zhì)，電噴霧電離／離子阱質(zhì) 譜 法 （electro－spray ionization／ion trap mass spectrometry，ESI／MS）對(duì)提取物中這4種黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行鑒別，首次發(fā)現(xiàn)金線蓮中含有異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷，為金線蓮的藥理作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 金線蓮干燥全草（福州同春藥業(yè)有限公司），產(chǎn)地廣西和福建，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系張永紅教授鑒定。

1.1.2 試劑 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷（批號(hào)：111571－200402，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；異槲皮苷（批號(hào)：43089，阿拉丁試劑公司）；槲皮素（批號(hào)：1216002，阿拉丁試劑公司）；異鼠李素（批號(hào)：35961，阿拉丁試劑公司）；甲醇（色譜純）、乙酸（分析純）、氨水（分析純）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水皆為實(shí)驗(yàn)室自制二次蒸餾水。

1.1.3 儀器 傾倒式粉碎機(jī)（DJ－10A，上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52AA）、自動(dòng)三重純水蒸餾器（SZ－97）（上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（752PC，上海光譜儀器有限公司）；電子天平（BS 110S，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器（KQ－250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；HPLC－MSD高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（1200型）、Agilent TC－C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）（美國(guó) Agilent公司）；高效液相色譜儀（LC－20A，日本島津公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB－III，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；低速多管離心機(jī)（80－2型，常州國(guó)華電器有限公司）。

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A 為0.8%乙酸＋0.2%氨水溶液，B為甲醇；流速：1.0mL／min；梯度洗脫：0～10min，50%～58%B，10～30min，65%B；檢測(cè)波長(zhǎng)368nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI源），正離子監(jiān)測(cè)，ESI（＋）；噴霧氣和干燥氣都是氮?dú)?，簾氣（噴霧氣）：30psi；碰撞氣（CAD）流速15mL／min；源噴射電壓（IS）：4000V；源溫度（TEM）：350℃；加熱氣（GS2）：60psi。掃描范圍：異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷的質(zhì)荷比（m／z）為50～700；其他3種物質(zhì)為50～500。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制 分別精確稱(chēng)取異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對(duì)照品0.010 0，0.010 0，0.010 5，0.010 0g，用少量甲醇超聲溶解后定容至10mL容量瓶中，異鼠李素定容至50mL容量瓶中，制得濃度分別為1.00，1.00，1.05，0.20mg／mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，備用。臨用時(shí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 供試品溶液的配制 精確稱(chēng)取金線蓮樣品1g，置小燒杯中，用20mL甲醇超聲萃取30min，提取溫度為45℃，3 000r／min離心10min，取上清液。濾渣重復(fù)提取2次，合并上清液，置于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮萃取液少量多次用甲醇溶解，并定容于5mL容量瓶中，即得供試品溶液，待測(cè)。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液（其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素濃度分別為50，40，42，50μg／mL）在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)其峰面積。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24h進(jìn)樣，測(cè)待測(cè)組分的峰面積。

1.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。

3.3 記憶力 記憶力主要指識(shí)記、保持、再認(rèn)識(shí)、重現(xiàn)客觀事物所反映出來(lái)的內(nèi)容及經(jīng)驗(yàn)的能力，其是認(rèn)知功能研究的重要方面，良好的睡眠可有效促進(jìn)新記憶的保存及鞏固，而失眠患者往往受到睡眠缺失的影響，無(wú)法進(jìn)行正常的記憶鞏固，導(dǎo)致失眠患者的記憶能力受損，通常表現(xiàn)為記憶鞏固功能受損、學(xué)習(xí)能力下降、長(zhǎng)時(shí)記憶受損等。失眠患者對(duì)記憶的保存及整合能力受損的主要因素是慢波睡眠減少，而快速動(dòng)眼期在失眠患者的記憶鞏固中發(fā)揮重要作用。許良和王博[21]對(duì)1 954例失眠患者進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴有記憶力減退的患者約占80.71%。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱(chēng)取12份已知含量的金線蓮樣品，平分為4組，按高、中、低水平分別精密加入4種黃酮物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按樣品溶液制備的方法操作及前述色譜條件測(cè)定峰面積。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和金線蓮提取物的HPLC－UV分析

在上述選擇的色譜條件下，采用UV法得到4種黃酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)品、金線蓮超聲萃取物的HPLC分離的色譜圖。圖1為標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的保留時(shí)間分別為6.534，7.913，14.498，18.622min。根據(jù)色譜的保留時(shí)間和加入標(biāo)準(zhǔn)品于樣品中，樣品中對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)保留時(shí)間處峰高增高，圖2中1～4號(hào)峰初步鑒定為異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素。

圖1 混合對(duì)照品的色譜圖Fig 1 Chromatograms of mixing standard solution

圖2 樣品的色譜圖Fig 2 Chromatograms of the sample

2.2 LC－MS分析 在上述1.2.2質(zhì)譜條件下，對(duì)異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對(duì)照品和保留時(shí)間分別6.534，7.913，14.498和18.622min樣品的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)照品質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。金線蓮超聲提取物色譜圖對(duì)應(yīng)1～4號(hào)色譜峰的ESI／MS質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，4種黃酮主要二級(jí)質(zhì)譜碎片歸屬見(jiàn)表1。

圖3 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對(duì)照品的電噴霧離子源質(zhì)譜圖Fig 3 ESI／MS of isorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin standard substance

圖4 樣品中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的電噴霧離子源質(zhì)譜圖Fig 4 ESI／MS of isorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin in sample

基于質(zhì)譜的m／z值推斷，異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的可能裂解途徑見(jiàn)圖5。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系的考察 分別精密移取上述儲(chǔ)備液各1.0mL（異鼠李素5.0mL）于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，混勻配成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各濃度依次為100，100，105，100μg／mL。按等比對(duì)半稀釋原則分別置于10mL的容量瓶中，甲醇定容，得到一系列混合對(duì)照品溶液（濃度見(jiàn)表2），在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，測(cè)定3次，得峰面積平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)y，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)x（μg／mL），進(jìn)行線性回歸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素裂解途徑Fig 5 A tentative pathway for the mass spectral fragmentation of sorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin

表1 4種黃酮主要二級(jí)質(zhì)譜碎片歸屬Tab 1 The second class mass spectrum relegation of the four kinds of flavonoids

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 測(cè)得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）分 別 為 3.51%，2.92%，2.69% 和2.06%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的RSD分別為2.64%，2.12%，2.83%和2.89%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 系列混合對(duì)照品溶液濃度Tab 2 Series of mixed reference solution concentration table μg／mL

表3 4種組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 3 Regression equation，correlation coefficient and linear range of the four constituents

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 測(cè)得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.58%，2.67%，2.35%，2.94%。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 測(cè)得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素的平均回收率分別為94.26%，95.86%，96.31%，95.46%；RSD分別為0.87%，0.80%，0.95%，1.27%。

2.5 樣品測(cè)定 取福建和廣西2個(gè)產(chǎn)地金線蓮細(xì)粉，按供試品溶液制備方法各制備5份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素含量分別為福建產(chǎn)地0.094，0.053，0.039 和 0.070mg／g，廣 西 產(chǎn) 地0.089，0.067，0.042和0.061mg／g。

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于甲醇中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在200～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，4種物質(zhì)有2個(gè)吸收峰，峰位分別在254和368nm附近。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定在254nm時(shí)，樣品峰多，干擾組分的測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為368nm時(shí)，各組分與干擾能很好分開(kāi)，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為368nm。

3.2 流動(dòng)相及梯度洗脫條件的選擇 為了得到較好的色譜圖和適宜的出峰時(shí)間，曾比較不同體系或比例的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)表明，乙腈－水體系分離效果較差，很難將所測(cè)的4種黃酮類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)；甲醇－水體系可以基本將所測(cè)的4種黃酮類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)，但是異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷分離度不高且槲皮素、異鼠李素峰形不好，難以使兩者達(dá)到較好的檢測(cè)水平，所以采用梯度洗脫并加入乙酸調(diào)節(jié)pH能得到較好的峰形和分離度，經(jīng)比較0.6%乙酸和0.8%乙酸，發(fā)現(xiàn)0.8%乙酸并加入0.2%氨水最適宜，再進(jìn)一步以甲醇和0.8%乙酸與0.2%氨水作流動(dòng)相進(jìn)行流動(dòng)相配比試驗(yàn)，最終選定的方案為0～10min，50%～58%B；10.01～30min，65%B，分離度較好，保留時(shí)間和峰形都較佳。異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷與異槲皮苷、異槲皮苷與槲皮素、槲皮素與異鼠李素的分離度分別為1.74，4.76，1.98，此時(shí)這4種黃酮類(lèi)物質(zhì)可以完全分離。

3.3 提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲醇和乙醇超聲提取，表明甲醇超聲提取率較乙醇高。而用甲醇回流和甲醇超聲其提取率相當(dāng)，但考慮到超聲提取實(shí)驗(yàn)較簡(jiǎn)便，則選擇甲醇超聲提取法提取金線蓮中4種黃酮類(lèi)化合物。

3.4 質(zhì)譜定性 基于m／z值、色譜保留時(shí)間、對(duì)照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析[21－24]，圖2中1～4號(hào)峰分別鑒定為異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素。

綜上所述，不同產(chǎn)地金線蓮中這4種具有重要藥理活性黃酮類(lèi)化合物含量的差異不大，為金線蓮的藥理作用和開(kāi)發(fā)應(yīng)用的研究提供實(shí)驗(yàn)方法和理論基礎(chǔ)。

[1]蔡文燕，肖華山，范秀珍.金線蓮研究進(jìn)展[J].亞熱帶植物科學(xué)，2003，32（3）：68－72.

[2]Shyur L F，Chen C H，Loa C P，etal.Induction of apoptosis in MCF－7human breast cancer cells by phytochemicals from Anoectochilus formosanus[J].BiomedSci，2004，11：928－939.

[3]陳少卿，張桂才，李澤賢，等.廣東藥用植物手冊(cè)[M].廣州：廣東人民出版社，1982：720.

[4]Takuya K，Naoto I，Yasuhiro K，etal.Antioxidant flavonol glycosides in mulberry（Morus alba L.）leaves isolated based on LDL antioxidant activity[J].FoodChemistry，2006，9（7）：25－31.

[5]Shyur L F，Yang N S，Chen C H，etal.Use of Anoectochilus formosanus plant extracts and their derived fractions herbal medicines or nutraceut－ical supplements for chemoprevention or treatment of human malignancis[J].USPatApplPubl，2004，25（10）：424.

[6]魯成巍，冉景丞.金線蓮研究進(jìn)展及保護(hù)利用研究[J].農(nóng)技服務(wù)，2010，27（8）：1040－1042.

[7]王 航.金線蓮有效成分的降血糖作用及其機(jī)制的研究[J].海峽藥學(xué)，2009，21（12）：46－48.

[8]Du X M，Ning Y，Nobuto I，etal.Glycoside constituents from Anoectochilus formosanus [J ].Chemical ＆ PharmaceuticalSciences，2000，48（11）：1803－1804.

[9]Wang S Y，Kuo Y H.Profiling and characterization antioxidant activities in Anoectochilus formosanus Hayata [J].J AgriFoodChem，2002，50（7）：1859－1865.

[10]曹揚(yáng)遠(yuǎn)，朱壁潔，王 勇，等.RP－HPLC測(cè)定金線蓮超聲－微波協(xié)同萃取物中3種活性成分的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2007，1（5）：1－3.

[11]張婷婷，周勁松，王 強(qiáng).HPLC法測(cè)定柴胡屬植物地上部分黃酮含量（Ⅲ）[J].中國(guó)天然藥物，2010，8（2）：107－113.

[12]何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（8）：581－583.

[13]何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究（Ⅲ）[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2005，17（3）：259－262.

[14]吳萍萍.金線蓮活性物質(zhì)分析及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2013.

[15]吳立軍，吳繼洲，王鋒鵬，等.天然藥物化學(xué)[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：169－180.

[16]李志浩，孫新建，瞿京紅，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方蒲黃片中香蒲新苷與異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（4）：503－505.

[17]Feng S L，He L，Wang M，etal.Studies on the chemical constituents of flower of David Lily[J].ChinaJChineseMaterMed，1994，（9）：611.

[18]張利斌，張曉慶，李玉平.異槲皮苷抗抑郁作用實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2011，29（4）：272－273.

[19]孫 涓，余世春.槲皮素的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（3）：85－87.

[20]唐光明，柯立堅(jiān).HPLC法測(cè)定蒲黃片中異鼠李素的含量[J].中國(guó)藥事，2008，22（8）：678－694.

[21]馬紅飛.蒲黃炒炭化學(xué)成分研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[22]孫 蘭，余競(jìng)光，周立東，等.中藥砂仁中的黃酮苷化合物[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27：36－38.

[23]張淑敏，曲桂武，解飛霞，等.蒲黃化學(xué)成分研究[J].中草藥，2008，39（3）：351－354.

[24]楊念云，段金戚，李 萍，等.金錢(qián)草中黃酮類(lèi)化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（21）：1621－1625.