鎂離子對CCl4肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α和Caspase-3含量的影響

孫設(shè)宗趙杰官守濤唐微劉興林

(湖北醫(yī)藥學(xué)院生化與免疫學(xué)實(shí)室，湖北十堰442000)

摘要〔〕目的研究鎂離子對四氯化碳(CCl4)致肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Caspase-3含量的影響。方法3月齡昆明種小鼠隨機(jī)分為模型組和對照組(常規(guī)飼料，飲自來水)；鎂離子低、中、高保護(hù)組(常規(guī)飼料，飲水中以MgSO4的形式分別加入10、20、40 mmol/L 的鎂離子)；飼養(yǎng)10 d，第11天對照組腹腔注射豆油溶液，其余各組腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液，24 h 眼球取血，分離血清測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酸(ALT)。處死小鼠，取出肝臟稱重,計(jì)算肝體指數(shù)，冰浴下制備肝勻漿，測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3的含量。結(jié)果CCl4肝損傷模型組小鼠肝體指數(shù)增大、MDA含量增加，ALT、 NOS活性增高；GSH含量減少，GSH-Px活性降低，NO、TNF-α、Caspase-3的含量增高；不同濃度的鎂離子保護(hù)組，能降低肝體指數(shù)、降低MDA含量和ALT、 NOS的活性；提高GSH含量，增加GSH-Px活性，降低NO、TNF-α、Caspase-3的含量(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論鎂離子具有對抗和清除自由基作用，提高抗氧化酶活性，抑制TNF-α的分泌，降低Caspase-3的含量，對CCl4肝損傷有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕鎂離子；肝損傷；腫瘤壞死因子(TNF)-α；Caspase-3

中圖分類號(hào)〔〕R39〔

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(鄂教科〔2007〕4號(hào)B200724001)

通訊作者：唐微(1965-)，男，博士，教授，主要從事藥用蛋白基因工程研究。

第一作者：孫設(shè)宗(1954-)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生化藥理研究。

各種原因的肝病發(fā)病機(jī)制雖不盡相同，但與自由基引發(fā)氧化應(yīng)激、生物膜的脂質(zhì)過氧化、腫瘤壞死因子α(TNF-α)異常分泌及Caspase-3激活密切相關(guān)〔1～4〕。鎂離子是生物體內(nèi)第二大陽離子，是多種酶的輔酶。研究表明鎂離子具有良好的抗氧化作用，對肝損傷有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。本研究探討鎂離子對四氯化碳(CCl4)致肝損傷一氧化氮(NO)、TNF-α及Caspase-3含量的影響。

1材料與方法

1.1材料3月齡昆明種小鼠50只，雌雄各半體重32～36 g，由本院動(dòng)物中心提供。丙二醛(MDA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余為國產(chǎn)分析純生化試劑。ZS83- 1 型內(nèi)切式組織勻漿機(jī)(浙西機(jī)械廠)，722S型分光光度計(jì)(上海第二光學(xué)儀器廠)，RA- 50 半自動(dòng)生化分析儀(美國Technicon 公司)，酶標(biāo)儀(上海第二光學(xué)儀器廠)。

1.2方法小鼠50只隨機(jī)分為五組，每組10只，模型組及對照組：常規(guī)飼料，飲自來水；鎂離子低、中、高保護(hù)組：常規(guī)飼料，飲水中以硫酸鎂(MgSO4)的形式分別加入10、 20、40 mmol/L 的鎂離子；飼養(yǎng)10 d，第11天對照組腹腔注射豆油溶液，其余各組腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液(10 ml/kg),12 h后禁食不禁水， 24 h 眼球取血，分離血清，用速率法測ALT、處死小鼠，取出肝臟置冰生理鹽水中洗凈血液,用濾紙吸去水分稱重，計(jì)算肝體指數(shù)(肝重/體重)，用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液PBS 按1∶10稀釋冰浴下勻漿，4 000 r/min 離心5 min，取上清液用雙縮脲法測肝勻漿中蛋白質(zhì)含量，用PBS 稀釋成4 mg/ml蛋白，按試劑盒要求測GSH-Px、NOS活性及MDA、GSH、NO、TNF-α、Caspase-3的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1鎂離子對CCl4肝損傷小鼠肝體指數(shù)、ALT活性、MDA含量的影響模型組與對照組比較，肝體指數(shù)增大、MDA含量和ALT活性升高(P<0.01)，說明造模是成功的。不同濃度的鎂離子保護(hù)組能降低肝體指數(shù)、降低MDA含量和ALT活性，但降低MDA含量和ALT活性與鎂離子濃度成比關(guān)系，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

2.2鎂離子對CCl4肝損傷小鼠GSH含量及GSH-Px、NOS活性的影響與對照組比較，模型組GSH-Px活性下降、GSH含量降低、NOS活性升高(P均<0.05)；不同度的鎂離子能提高GSH-Px活性和GSH含量、降低NOS活性，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。見表2。

2.3鎂離子對CCl4肝損傷小鼠NO、TNF-α及Caspase-3含量的影響與對照組比較，模型組NO、TNF-α含量和Caspase-3活性明顯升高；不同濃度的鎂離子能降低NO、TNF-α含量和Caspase-3活性，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

組別肝體指數(shù)MDA(nmol/mg)ALT活性(U/L)模型組0.0505±0.00415.96±1.28234.77±31.68對照組0.0449±0.00812)4.05±1.682)29.81±11.022)鎂離子低劑量組0.048±0.00484.78±1.781)198.13±19.222)鎂離子中劑量組0.0474±0.00231)4.69±1.971)141.25±73.212)鎂離子高劑量組0.0453±0.00182)4.17±1.632)122.15±65.872)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

組別GSH-Px(U/mg)GSH(mg/g)NOS(U/mg)模型組579.65±14.1611.69±0.883.49±1.02對照組608.36±4.762)15.17±1.612)1.48±0.372)鎂離子低劑量組604.89±3.432)13.92±0.932)1.91±0.872)鎂離子中劑量組603.21±12.312)13.38±0.422)2.61±0.392)鎂離子高劑量組608.91±5.812)14.11±1.232)3.15±0.41

組別NO(nmol/ml)TNF-α(ng/ml)Caspase-3(μmol/L)模型組4.65±0.932133.76±17.3642.91±22.93對照組3.11±0.9262)107.62±13.872)6.78±3.8182)鎂離子低劑量組3.79±0.3261)94.61±7.672)14.23±6.7352)鎂離子中劑量組3.39±0.5922)110.27±8.812)18.95±15.812)鎂離子高劑量組3.82±1.271120.72±8.891)12.65±5.6352)

3討論

脂質(zhì)過氧化代謝的終產(chǎn)物MDA，可直接激活Kupffer 細(xì)胞，使之分泌TNF-α等細(xì)胞因子；適量的TNF-α可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，對維持機(jī)體的正常穩(wěn)定狀態(tài)及抵御各種致病因子有著重要的作用。而TNF-α的異常分泌又可作為機(jī)體炎癥、損傷和休克的重要炎性介質(zhì)，參與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程〔5〕。TNF-α的作用主要有以下幾個(gè)方面：①TNF-α可激活肝星狀細(xì)胞進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞；② TNF-α可誘導(dǎo)NOS的基因表達(dá)增加NOS的活性，促進(jìn)NO的合成；增加肝臟NO的含量，過量的NO能與氧自由基反應(yīng)生成氧化性更強(qiáng)的超氧化亞硝基陰離子(ONOO-)進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞；另一方面NO 過高可直接抑制線粒體呼吸，使肝細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙而引起肝細(xì)胞凋亡和壞死。③TNF-α能抑制線粒體融合蛋白基因2(Mfn2)表達(dá),引起細(xì)胞線粒體損傷，抑制線粒體的呼吸功能并增加線粒體活性氧和過氧化脂質(zhì)的形成〔6，7〕。本研究說明鎂離子抗CCL4肝損傷的機(jī)制與抑制TNF-α的分泌有關(guān)。

許多疾病都與細(xì)胞凋亡正、負(fù)向精確調(diào)控失誤有關(guān)，細(xì)胞過度凋亡或凋亡過度抑制時(shí)則引起疾病。各種原因的肝損傷、肝炎、肝腫瘤等疾病都與細(xì)胞凋亡存在著密切聯(lián)系〔8〕。Caspase-3正常情況下以酶原的形式存在，氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的TNF-α，內(nèi)毒素、線粒體損傷均可激活Caspase-3從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此Caspase-3與急慢性肝損傷密切相關(guān)〔9〕。

綜上，鎂離子可通過對抗自由基的生成，降低肝體指數(shù)、MDA含量和ALT活性；增加GSH的含量和GSH-Px活性，抑制TNF-α的分泌、降低NOS活性和NO的含量，抑制Caspase-3的活性，對CCl4肝損傷有保護(hù)作用。鎂離子具有第二信使作用，但鎂離子抑制TNF-α的分泌和Caspase-3的活性的作用機(jī)制，是否也存在信號(hào)傳導(dǎo)途徑還需進(jìn)一步探討。

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〔2013-07-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)