馬 琦邊云飛白 瑞魯 燕肖傳實(shí)*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西 太原 030001）

吡咯列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化

馬 琦1邊云飛2白 瑞2魯 燕1肖傳實(shí)1*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西 太原 030001）

目的探討吡咯列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化影響。方法利用β-甘油磷酸鈉聯(lián)合丙酮酸鈉制備鈣化血管平滑肌細(xì)胞模型，予不同濃度（10、50、100 μmol/L）吡咯咧酮干預(yù)。用Von Kossa染色及茜素紅S染色觀察細(xì)胞鈣化程度，用甲基百里香酚藍(lán)法測(cè)定各組細(xì)胞中鈣含量，磷酸苯二鈉法測(cè)定細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）活性。采用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞PPAR-γ、GRP78和caspased-12表達(dá)。觀察吡咯列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化影響及其可能的分子機(jī)制。結(jié)果鈣化血管平滑肌細(xì)胞其鈣含量、ALP活性較普通細(xì)胞增多（P＜0.01），而吡格列酮呈劑量依賴性地促進(jìn)鈣化大鼠血管平滑肌細(xì)胞的鈣含量、ALP活性，以及PPAR-γ、GRP78、caspase-12mRNA表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論吡咯列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑作用可促進(jìn)β-磷酸甘油誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，其作用可能與PPAR-γ及GRP78、caspase-12表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

血管鈣化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；血管平滑肌細(xì)胞；吡咯列酮

血管鈣化（vascular calcification，VC）是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變、血管損傷、慢性腎病和衰老等普遍存在的病理表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為血管壁僵硬性增加，順應(yīng)性降低，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血、左心室肥大和心力衰竭，引發(fā)血栓形成，斑塊破裂，是心腦血管疾病高發(fā)病率和高病死率的重要因素之一，80%血管損傷和90%冠心病患者伴有VC[1]。新近研究表明凋亡在血管平滑肌細(xì)胞鈣化過程中發(fā)揮了重要作用，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡有關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮（Pioglitazone，PIO）對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，但吡格列酮是否通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡來促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生鮮有報(bào)道。本研究在體外血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）鈣化模型[4]基礎(chǔ)上，探討吡格列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑對(duì)血管鈣化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑：SD大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。吡格列酮（沈陽施德），GW9662（sigma公司），DMEM高糖型培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（杭州四季青公司），特異性小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（武漢博士德）DAB顯色試劑盒（武漢博士德），鈣離子定量檢測(cè)試劑盒和堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL試劑盒（羅氏公司）SP免疫組化試劑盒（北京博奧森），余為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VSMCs培養(yǎng)及鑒定：采用無菌方法取160 g左右Sprague-Dawley雄性大鼠胸主動(dòng)脈中膜，將中膜剪成約1 mm×1 mm大小，貼培養(yǎng)皿底部，放入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，用0.125%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)選用第5～10代細(xì)胞。經(jīng)SMα-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定為平滑肌細(xì)胞。

1.2.2 分組及處理：取上述平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，分別置于六孔板中進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分6組：①空白對(duì)照組（加入10%DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液）；②鈣化組（加入鈣化培養(yǎng)基，鈣化培養(yǎng)基是在常規(guī)培養(yǎng)基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸（β-GP）和10 mmol/L丙酮酸鈉）；③鈣化+PPAR-γ抑制劑（加入鈣化培養(yǎng)基、25 mmol/L GW9662）；④鈣化+PIO（10、50、100 μmol/L）組（加入鈣化培養(yǎng)基中以及加入不同濃度（10、50、100 μmol/L吡格列酮）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞每隔兩天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)15 d[4]。

1.2.3 VSMCs鈣化的染色鑒定：取1.5 cm×0.5 cm的蓋玻片數(shù)枚放入6孔板內(nèi)，以1.2×105接種密度進(jìn)行細(xì)胞爬片。分別制作實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞爬片。取出蓋玻片先用預(yù)冷4 ℃的PBS緩沖液洗滌2次，浸入冰丙酮中固定20 min。①將細(xì)胞玻片放入1%茜素紅S溶液內(nèi)染色30 min，用0.2%醋酸溶液快速?zèng)_洗l次，濾紙吸干。系列酒精脫水，二甲苯固定、封片。顯微鏡下鈣鹽沉積處被染為橘紅色。②Von Kossa染色：將細(xì)胞玻片放入5%硝酸銀溶液避光孵育15 min，紫外燈照射10 min，洗滌后浸入1%硫代硫酸銨溶液1 min，洗滌后堿性品紅復(fù)染。顯微鏡下觀察鈣鹽沉積處為黑色。

1.2.4 VSMCs的鈣含量測(cè)定：棄上層培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入適量0.6 N鹽酸，37 ℃去鈣化作用24 h。采用鈣離子定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。剩余細(xì)胞用PBS洗3次，加入0.05 mol/L NaOH/0.1% SDS細(xì)胞裂解液，30 min后提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法蛋白分析試劑盒測(cè)定總蛋白，鈣含量用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5 VSMCs的堿性磷酸酶活性測(cè)定：棄上層培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入適量含1%TritonX-100的生理鹽水，置于4 ℃冰箱24 h。用超聲波處理25 s后反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分破裂（倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞破碎、無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)），離心后取上清用堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒測(cè)定ALP活性。測(cè)量時(shí)提取胞質(zhì)蛋白并測(cè)定總蛋白含量，用其校正細(xì)胞層ALP活性。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMCs凋亡率：各組細(xì)胞用0.25%胰酶（無EDTA）消化，血清終止消化后轉(zhuǎn)移至離心管，1000 rpm離心10 min，棄上清，用PBS沖洗2～3次，棄上清，每管500 μL buffer重懸，分別加入AnnexinV-FITC，PI染液各5 μL，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

1.2.7 TUNEL法檢測(cè)VSMCs凋亡率：棄上層培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，采用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，即TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)，之后用DAPI染液染色封片，熒光倒置顯微鏡下觀察。TUNEL陽性呈綠色熒光，DAPI呈藍(lán)色熒光。每個(gè)細(xì)胞爬片觀察4個(gè)獨(dú)立視野，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞的凋亡個(gè)數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.8 RT-PCR測(cè)定GRP-78，caspase-12和PPAR-γ mRNA的表達(dá)：見表1。應(yīng)用RNA提取試劑盒提取RNA，并用微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)其吸光度在1.8～2.0，其后取5 μL RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 GRP78、caspase-12、PPAR-γ、β-actin引物序列

2 結(jié) 果

2.1 血管平滑肌鑒定：倒置顯微鏡下觀察，可見原代平滑肌細(xì)胞從組織塊邊緣游出（圖1A）血管平滑肌細(xì)胞呈梭型，逐漸呈現(xiàn)束狀排列，出現(xiàn)典型的“峰谷樣”樣生長(zhǎng)。經(jīng)特異性免疫組化SMα-actin染色，可見胞質(zhì)內(nèi)SMα-actin表達(dá)豐富，細(xì)絲狀排列，符合血管平滑肌細(xì)胞特征。

2.2 鈣化的血管平滑肌細(xì)胞鑒定：倒置顯微鏡下觀察，可見血管平滑肌細(xì)胞透明度下降，表現(xiàn)為多層生長(zhǎng)狀態(tài)，部分細(xì)胞脫死亡?？瞻讓?duì)照組與單純鈣化組相比：茜素紅S染色時(shí)，鈣化組（A2）與對(duì)照組（A1）比較可見橘紅色區(qū)域，散裝分布，證實(shí)有鈣鹽沉積；Von Kassa染色時(shí)，鈣化組（B2）與對(duì)照組（B1）比較可見黑色沉積區(qū)域，證實(shí)有鈣鹽沉積。

圖1 原代培養(yǎng)大鼠VSMCs及鑒定（×200）A，B為原代大鼠VSMCs，C為大鼠VSMCs SMα-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色

圖2 茜素紅S染色細(xì)胞結(jié)節(jié)處可見橘紅色沉積；Von Kossa染色細(xì)胞結(jié)節(jié)處可見黑色顆粒沉積

2.3 吡格列酮對(duì)VSMCs鈣含量、堿性磷酸酶活性：見表2。與對(duì)照組相比，鈣化組的鈣含量、ALP活性含量均升高（P＜0.01）；不同濃度吡格列酮組的鈣含量、ALP活性與鈣化組相比較均明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴。

表2 各組細(xì)胞鈣沉積含量、ALP活性比較（，n=4）

表2 各組細(xì)胞鈣沉積含量、ALP活性比較（，n=4）

注：a為P＜0.01，與空白對(duì)照組相比；b為P＜0.05，與鈣化組相比

分組 Total Ca2+content (mmol/g )ALP activity (KU /g )空白對(duì)照組 48.10 ± 2.39 48.85±1.21鈣化組 138.32±5.95a 220.70±1.68a鈣化+10μmol/L PIO 147.70±2.46ab 260.97±3.17ab鈣化+50μmol/L PIO 160.25 ±2.02ab 369.57±1.15ab鈣化+100μmol/L PIO 185.27±5.56 ab 411.85±2.26 ab鈣化+GW9662 111.47 ±1.68 176.52±3.10

2.4 吡咯咧酮對(duì)VSMCs凋亡的影響：鈣化組與對(duì)照組相比，出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，差異顯著（P＜0.01）；不同濃度吡咯列酮處理后在流式圖中B4區(qū)和B2區(qū)的細(xì)胞分布均明顯增多，即促進(jìn)了細(xì)胞鈣化造成的凋亡和壞死，凋亡率均較鈣化組明顯減低（P＜0.05），且吡咯列酮的作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（表3和圖3）。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（，n=4）

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（，n=4）

注：a為P＜0.01，與對(duì)照組比較；b為P＜0.05，與鈣化組比較

分組 凋亡率(%)空白對(duì)照組 4.35±3.04鈣化組 14.40±3.11a鈣化+10μmol/L PIO 17.49±9.45ab鈣化+50μmol/L PIO 18.75±2.19ab鈣化+100μmol/L PIO 25.4±4.10ab鈣化+GW9662 11.0±1.20

圖3 各組VSMCs凋亡率的比較

2.5 TUNEL法檢測(cè)各組VSMCs凋亡率：倒置熒光顯微鏡下觀察，可見TUNEL陽性信號(hào)呈綠色熒光，而所有細(xì)胞核經(jīng)DAPI熒光染料復(fù)染后，呈藍(lán)色。與對(duì)照組相比，鈣化組和鈣化+PIO處理組凋亡細(xì)胞增多，差異顯著（P＜0.01）；PIO處理組與鈣化組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率

2.6 GRP-78、caspase-12及PPAR-γ mRNA的表達(dá)：與空白組比較，鈣化組和鈣化組+PIO處理組，GRP-78、caspase-12及PPAR-γ mRNA表達(dá)增高，差異顯著（P＜0.01）；與鈣化組比較，鈣化+PIO處理組GRP-78、caspase-12及PPAR-γmRNA表達(dá)顯著增高（P＜0.05），且呈劑量依賴。見圖5。

3 討 論

圖5 各組VSMCs mRNA表達(dá)的比較a為P＜0.01，與空白對(duì)照組相比；b為P＜0.05，與鈣化組相比。

血管鈣化與冠心病、心肌梗死、腦卒中等多種疾病相關(guān)，是發(fā)生心、腦血管急癥的重要危險(xiǎn)因子。以往認(rèn)為VC是鈣鹽在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)的被動(dòng)沉積，近年來研究發(fā)現(xiàn)VC是一種與骨發(fā)育類似的主動(dòng)的、可調(diào)控的生物學(xué)過程，類似于骨和軟骨形成過程中的骨化，主要特征是血管細(xì)胞尤其是血管平滑肌細(xì)胞成骨樣表型轉(zhuǎn)換[5-6]。隨血管平滑肌細(xì)胞組織鈣化的進(jìn)展，原有的細(xì)胞功能發(fā)生改變，具備了骨細(xì)胞的特征和功能，呈現(xiàn)出骨細(xì)胞特異性蛋白及基因表達(dá)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境在外界環(huán)境影響下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)發(fā)生未折疊或者異常蛋白蓄積，導(dǎo)致“未折疊蛋白反應(yīng)。”已有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與細(xì)胞凋亡的過程，通過上調(diào)GRP78來發(fā)揮作用[7]，同時(shí)GRP78被公認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志。caspase-12的激活是促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的重要途徑。Proudfoot等[8]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：人體VSMC在鈣化發(fā)生前就出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征，其培養(yǎng)l周后出現(xiàn)來源于VSMC凋亡小體的基質(zhì)囊泡（基質(zhì)囊泡是正常軟骨內(nèi)骨鈣化的生發(fā)中心）；進(jìn)而說明了凋亡小體的功能類似骨基質(zhì)囊泡，其能夠蓄積鈣，促進(jìn)VSMC骨相分化。

吡格列酮作為PPAR-γ激活劑已廣泛應(yīng)用于臨床糖尿病的治療，除此之外，有報(bào)道稱該類藥物可減輕動(dòng)脈粥樣硬化和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過快速激活TGFβ1，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[9]。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ激活時(shí)，凋亡相關(guān)基因p53和bal-2出現(xiàn)異常表達(dá)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡[10]。但吡咯咧酮是否通過激活PPAR-γ，進(jìn)而影響血管平滑肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用體外BGP誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，觀察比格咧酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)離體的血管平滑肌細(xì)胞可以形成明顯的礦化結(jié)節(jié)，鈣含量及ALP活性較對(duì)照組明顯增加，標(biāo)志著局部細(xì)胞已發(fā)生成骨細(xì)胞樣化。血管平滑肌細(xì)胞鈣化后，凋亡率明顯增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)GRP78及caspase-12mRNA水平明顯增加；同時(shí)比格咧酮處理后，上述改變加重。結(jié)果證實(shí)比格咧酮可以促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，促使血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能是作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過上調(diào)GRP78及caspase-12，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)加重，引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加重細(xì)胞鈣化。但抑制PPAR-γ活性作為很有前途的抗血管鈣化手段，還需對(duì)其在VC中的作用做進(jìn)一步研究。

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Pioglitazone Increases Calcification of Rat Vascular Smooth Muscle Cells by Endoplasmic Reticulum Stress Apoptotic Pathway

MA Qi1, BIAN Yun-Fei2, BAI Rui2, LU Yan1, XIAO Chuan-Shi1*
(1 Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo explore the impact of pioglitazone by endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway on calcification of rat vascular smooth muscle cells in vitro, and its signal transduction and molecular mechanisms.MethodsCalcification of cultured rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)was produced by with β-glycerophosphate(β-GP) and sodium pyruvate. The vascular smooth muscle cells cells (VSMCs) were treat with (10, 50, 100 μmol/ L) pioglitazone. Von kossa staining and alizarin red staining, calcium content, alkaline phosphatase activity were analyzed to estimate the extent of calcification. The apoptoticrate was analyzed by flowcy tometry and TUNEL. The mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR-γ), glucose regulated protein 78 (GRP78)and cysteine-containing aspartate-specific proteases-12 (caspase-12) were detected by quantitative real-time RT-PCR.ResultsCompared with the normal VSMCs, the calcium content and, ALP activity of the cells of the calcified VSMCs were significantly higher (P＜0.05), pioglitazone in a dose-dependent manner to promote calcified rat vascular the calcium content of the smooth muscle cells (VSMCs) ALP activity, the cell apoptotic rate and the mRNA expression of PPAR-γ, GRP78 and caspase-12.ConclusionPioglitazone can promote β-glycerophosphate-induced calcification of vascular smooth muscle cells, pioglitazone promote calcification of vascular smooth muscle cells may be though by endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway.

Vascular calcification; Endoplasmic reticulum stress; Vascular smooth muscle cells; Pioglitazone

R54

B

1671-8194（2015）07-0013-04

*通訊作者：E-mail： ganxibaozhongxin@sina.com