戴利亞，張德亭，謝海嘯，張揚(yáng)，鄭芳秀，王明山（.溫州市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 35000；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 3505）

·臨 床 經(jīng) 驗(yàn)·

一個遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥家系的基因分析

戴利亞1，張德亭1，謝海嘯2，張揚(yáng)2，鄭芳秀2，王明山2
（1.溫州市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325015）

目的：對一個遺傳性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷癥家系進(jìn)行FⅪ基因突變的分析和家系調(diào)查，探討其分子發(fā)病機(jī)制。方法：檢測先證者及其家系成員活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ:C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅨ:C）、凝血因子Ⅻ活性（FⅫ:C）、FⅪ活性（FⅪ:C）和FⅪ抗原（FⅪ:Ag）含量等進(jìn)行表型診斷；用DNA直接測序法分析先證者FⅪ基因所有15個外顯子、側(cè)翼、5’和3’非翻譯區(qū)及家系成員相應(yīng)的突變位點(diǎn)區(qū)域，用反向測序證實(shí)所發(fā)生的突變。結(jié)果：先證者APTT延長為50.0 s （正常為27.0～41.0 s），先證者弟弟與兒子APTT同樣延長，分別為53.7 s和51.8 s，家系其他成員APTT無明顯延長；先證者及其弟弟、兒子、父親的FⅪ:C明顯減低，分別為22.5%、22.3%、35.5%和42.0%，F(xiàn)Ⅺ:Ag含量分別為29.0%、18.0%、29.0%和40.0%，表現(xiàn)為交叉反應(yīng)物質(zhì)（CRM）陰性；先證者母親凝血指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)。基因測序發(fā)現(xiàn)先證者及其父親、弟弟、兒子FⅪ基因第8號外顯子存在C16642T雜合無義突變，導(dǎo)致編碼第263位氨基酸谷氨酰胺提前出現(xiàn)終止密碼（Gln263stop）。結(jié)論：FⅪ基因第8號外顯子C16642T雜合無義突變是導(dǎo)致該遺傳性FⅪ缺陷癥家系FⅪ水平降低的主要原因。

凝血因子Ⅺ；家系；雜合；無義突變

遺傳性凝血因子XI（FXI）缺陷癥為常染色體隱性遺傳性疾病，曾被稱為血友病C，患者出血癥狀輕重不定，F(xiàn)XI水平高低與出血程度并不成正比，很少有自發(fā)性出血[1]。近年來的報道認(rèn)為，該缺陷癥的發(fā)生主要與FXI基因的突變有關(guān)[2-3]。本研究對一個遺傳性FXI缺陷癥家系進(jìn)行FXI基因突變分析和家系調(diào)查，初步探討其分子發(fā)病機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象

1.1.1 家系資料：該家系共3代5名成員，包括先證者及其父親、母親、弟弟和兒子。先證者，女，20歲，因“妊娠待產(chǎn)”收住入院。實(shí)驗(yàn)室檢查：活化部分凝血活酶時間（APTT）延長為50.0 s；凝血因子檢查發(fā)現(xiàn)FXI活性（FXI:C）為22.5%，F(xiàn)XI抗原含量（FXI:Ag）為29.0%。先證者肝腎功能正常，平素?zé)o明顯出血癥狀，無長期服用藥物史。先證者父母非近親結(jié)婚，詢問其家系成員均無出血史，家系譜見圖1。

圖1 遺傳性FXI缺陷癥家系圖

1.1.2 正常對照組：共106名，男62名，女44名，平均年齡32歲（16～60歲）。無肝腎功能疾病，無血栓出血史。征求本人同意，對上述人員采集血樣。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：STA-R全自動血凝儀（法國STAGO公司）、電泳儀（Bio-rad公司）、PCR擴(kuò)增儀（ABI Thermal cycler 2720）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2.2 引物：根據(jù)NCBI中的FXI基因序列（Genbank AY191837），應(yīng)用Primer 5軟件共設(shè)計(jì)13對引物以覆蓋FXI基因的15個外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列，由上海桑尼生物科技有限公司合成，見表1。

1.2.3 試劑：APTT、FXI:C等凝血試劑由法國STAGO公司配套提供；PCR試劑盒（Master Mix）由北京天根生化科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和處理：采集實(shí)驗(yàn)對象外周血標(biāo)本2管，0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，一管用于凝血功能檢測；另一管用于抽提DNA，-40 ℃凍存，用于PCR擴(kuò)增。

表1 FXI各引物序列及其PCR實(shí)驗(yàn)的退火溫度

1.3.2 凝血功能檢測：APTT、凝血酶原時間（PT）、凝血因子VIII活性（FVIII:C）、凝血因子IX活性（FXI: C）、凝血因子XII活性（FXII:C）均采用一期凝固法；FXI：Ag采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測。

1.3.3 DNA抽提：使用北京天根生化科技有限公司基因組DNA提取試劑盒抽提先證者及家系成員外周血基因組DNA。

1.3.4 PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系：反應(yīng)體積共50 μL，包括Taq PCR Mastermix 25μL，ddH2O 18μL，DNA模板3μL，正向引物2μL，反向引物2μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物分別以相應(yīng)退火溫度（53～60 ℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s（共35個循環(huán)），72 ℃延伸10 min。

1.3.5 電泳：5μL PCR產(chǎn)物采用Goldview標(biāo)記，在 1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.3.6 DNA序列分析：①家系分析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物工程有限公司測序，所用測序儀為ABI PRISM 3730。測序結(jié)果用Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的FXI基因序列（Genbank AY191837） 進(jìn)行比對，尋找基因突變位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列則反向測序予以證實(shí)。②正常對照：對正常對照組人群相應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，排除基因多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 先證者及家系成員凝血功能檢測結(jié)果 先證者APTT延長為50.0 s，先證者弟弟與兒子APTT同樣延長，分別為53.7 s和51.8 s，家系其他成員APTT無明顯延長；先證者及其父親、兒子、弟弟的FXI: C和FXI:Ag均有不同程度下降，結(jié)果見表2。

表2 FXI缺陷癥家系表型檢測結(jié)果

2.2 FXI基因分析結(jié)果 先證者及其父親、弟弟、兒子FXI基因第8號外顯子存在C16642T雜合無義突變，導(dǎo)致編碼第263位氨基酸谷氨酰胺提前出現(xiàn)終止密碼（Gln263stop）；對106名健康對照進(jìn)行篩查，排除了基因多態(tài)性的可能。基因型檢測結(jié)果見表3、圖2-3。

表3 先證者及家庭成員基因檢測結(jié)果

圖2 先證者FXI基因第8號外顯子的測序結(jié)果（16642位C＞T導(dǎo)致Gln263stop 雜合突變）

圖3 先證者母親FXI基因第8號外顯子相應(yīng)位置測序圖（正常野生型）

3 討論

FXI的編碼基因位于4號染色體長臂（4q35），總的基因長度為23 kb，含有15個外顯子和14個內(nèi)含子[4]。成熟的FXI在肝細(xì)胞和巨核細(xì)胞中合成，由2條相同分子量的多肽鏈通過二硫鍵連接形成二聚體。有報道[5]指出該同源二聚體結(jié)構(gòu)對FXI的有效分泌與功能發(fā)揮起著重要作用。FXI顯著的結(jié)構(gòu)特征為4個AP結(jié)構(gòu)域形成盤狀結(jié)構(gòu)及其所連接的催化域，4個AP結(jié)構(gòu)域有以下功能：AP1上有凝血酶結(jié)合位點(diǎn)；AP2上有HMWK結(jié)合位點(diǎn)；AP3與肝素、FIX、血小板膜糖蛋白（GP）Ib的結(jié)合有關(guān)；AP4第321位的半胱氨酸（Cys321）是2個FXI單體間通過二硫鍵形成 二聚體的部位[6]。

本資料先證者因“妊娠待產(chǎn)”行常規(guī)凝血功能檢測，發(fā)現(xiàn)APTT明顯延長，F(xiàn)XI:C和FXI:Ag含量明顯降低，因其抗原與活性水平均同步下降，屬于CRM陰性型。而其他內(nèi)源凝血途經(jīng)的凝血因子活性及抗原含量均在參考范圍之內(nèi)，臨床上診斷其為FXI缺陷癥。隨后的基因測序分析結(jié)果證明，先證者FXI基因第8號外顯子存在C16642→T雜合無義突變，從而導(dǎo)致編碼的263號氨基酸谷氨酰胺發(fā)生無義突變。家系分析發(fā)現(xiàn)先證者父親、弟弟及兒子存在同樣的突變位點(diǎn)，其FXI:C和FXI:Ag含量均有不同程度下降，表明先證者和其弟弟FXI基因第8號外顯子突變均遺傳于父親，而后又遺傳給兒子，因此可診斷為遺傳性FXI缺陷癥。王靜等[4]在1例遺傳性FXI缺陷癥家系基因缺陷研究中同樣發(fā)現(xiàn)了先證者FXI基因第8號外顯子存在C16642→T雜合無義突變，不同的是，該先證者FXI基因第2號外顯子還存在G3733C錯義突變。分析認(rèn)為E2區(qū)的錯義突變導(dǎo)致編碼最后一位信號肽的氨基酸發(fā)生G＞R替換，從而直接影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上信號肽的剪切，使得FXI蛋白質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔分泌障礙；而E8的無義突變使得編碼263位的氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼，形成截短型蛋白，該蛋白因缺失部分結(jié)構(gòu)域，高度不穩(wěn)定，并伴細(xì)胞內(nèi)迅速降解。筆者分析該雙重雜合突變導(dǎo)致其FXI:C及FXI:Ag明顯下降。而在本研究中，家系成員除先證者母親正常外，其余均為單一位點(diǎn)突變雜合子，因此認(rèn)為FXI基因第8號外顯子C16642T雜合無義突變是導(dǎo)致該遺傳性FXI缺陷癥家系FXI水平降低的主要原因。Quélin等[7]指出遺傳性FXI缺陷癥中基因突變的純合子和雙重突變雜合子可致血漿FXI:C下降至15%以下，單一位點(diǎn)突變雜合子為15%～70%。本研究中有基因突變的家系成員FXI:C水平與此相符。此外在1個中國香港人及2個日本人家系研究中發(fā)現(xiàn)的情況同樣如此，且對于該突變在東方人群中的一定流行率起一定支持作用[8-9]，但仍有待更多的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明。

FXI的第7、第8號外顯子編碼AP3結(jié)構(gòu)域，因此任何該二區(qū)的突變都可能會干擾FXI蛋白中AP3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)形成從而影響相關(guān)的功能。隨著當(dāng)前FXI晶體結(jié)構(gòu)的不斷完善，AP3結(jié)構(gòu)域的功能也不斷被發(fā)現(xiàn)，有結(jié)合FIX、肝素及血小板GPIb的作用。根據(jù)傳統(tǒng)的內(nèi)源性凝血途徑，由FXIa激活FIX來維持凝血過程繼續(xù)進(jìn)行，F(xiàn)XI通過AP3結(jié)構(gòu)域結(jié)合FIX，催化裂解FIX的Arg145-Ala146鍵，而后裂解Arg180-Val181鍵，最終活化FIX[10]。盡管在接觸系統(tǒng)中，血小板并不能促進(jìn)FXI的活化，然而更多的證據(jù)顯示在流體狀態(tài)下血小板能影響FXI及FXIa行為。雖然FXI缺乏γ-羥基谷氨酸結(jié)構(gòu)域，但強(qiáng)有力的證據(jù)顯示FXI可結(jié)合血小板[11-12]。Greengard等[13]認(rèn)為活化的血小板上約有1 500個FXI結(jié)合位點(diǎn)，由其上的血小板GPIb介導(dǎo)連接。另有報道[14]認(rèn)為FXI與血小板結(jié)合的最佳條件為FXI上的結(jié)合位點(diǎn)、血小板GPIb的氨基末端結(jié)構(gòu)域及HMWK和鋅離子，進(jìn)一步支持上述論斷。研究報道描述凝血酶首先利用其前表面陰離子結(jié)合位點(diǎn)I與FXI AP1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，再利用其后表面陰離子結(jié)合位點(diǎn)II與GPIb-IX-V復(fù)合物結(jié)合，所以當(dāng)FXI一單體的AP3結(jié)構(gòu)域與GPIb結(jié)合時，可通過另一單體的A1結(jié)構(gòu)域與相鄰的凝血酶反應(yīng)，從而得到激活。新的研究認(rèn)為FXI結(jié)合在血小板受體上，一種稱之為載脂蛋白E的物質(zhì)，血小板上該受體的數(shù)量 與FXI結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量相符[12]。有報道[15]指出，F(xiàn)XI AP3結(jié)構(gòu)域中Ser248、Arg250、Lys255、Phe250及 Gln263為血小板的結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中所檢測到的突變位點(diǎn)即為Gln263Stop。除卻王靜等[4]認(rèn)為無義突變發(fā)生時，mRNA水平可正常，但生成截短形式的蛋白質(zhì)高度不穩(wěn)定，并迅速被降解，也有研究[16]認(rèn)為無義突變產(chǎn)生的含有提前終止密碼子的mRNA可被無義介導(dǎo)衰變的mRNA監(jiān)視系統(tǒng)迅速降解。前者被認(rèn)為是循環(huán)中FXI減少的主要原因。

FXI基因缺陷發(fā)病相關(guān)的分子機(jī)制尚不完全清楚，即使有報道利用計(jì)算機(jī)軟件來對正常與異常FXI空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，從而利于了解基因缺陷對蛋白空間構(gòu)型變化和功能的影響，但仍缺少相關(guān)的客觀依據(jù)。因此本研究對于今后建立體外表達(dá)系統(tǒng)，以進(jìn)一步研究該因子基因突變致病的分子機(jī)制起一定的指導(dǎo)作用。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The gene analysis of a Chinese pedigree with congenital blood coagulation factor XI deficiency

DAI Liya1,ZHANG Deting1,XIE Haixiao2,ZHANG Yang2,ZHENG Fangxiu2,WANG Mingshan2.
1.Department of Laboratory,Wenzhou People’s Hospital,Wenzhou,325000; 2.Department of Laboratory,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Objective:To analyze genetic mutation and explore its molecular pathogenesis for a Chinese pedigree with congenital blood coagulation factor XI deficiency.Methods:Activated partial thromboplastin time (APTT),Prothrombin time (PT),FXI activity (FXI:C),FXI antigen (FXI:Ag) and other coagulant parameters were assayed.Exons 1-15,exon-intron boundaries and 5’,3’ untranslated sequences of FXI gene of the proband and other family members were analyzed by direct sequencing.The detected mutations were confirmed by sequencing the complementary strand.Results:The proband had prolonged APTT (50.0 s).The APTT results of her brother and son were prolonged too,which were 53.7 second and 51.8 second respectively.Other members’APTT were in normal range.The activity and antigen of proband’s FXI was 22.5% and 29.0%,while her brotherwas 22.3% and 18.0%,her son was 35.5% and 29.0%,her father was 42.0% and 40% separately,which were called cross-reactivity material negative.The mother of proband had normal results above-mentioned.After theamplification and sequencing of 15 extrons in FXI,an exon 8 C16642→T mutation in proband as well as in her father,brother and son was found,which led to an amino acid change of Gln→Term at residue 263.Conclusion:The mutation of C16642→T on exon 8 is the main reason for the congenital FXI deficiency in this Chinese pedigree.

blood coagulation factor XI; pedigree; heterozygosis; nonsense mutation

R394.3

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.014

2014-07-21

戴利亞（1982-），女，浙江瑞安人，主管檢驗(yàn)師。

王明山，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，Email：wyms@ 126.com。