二甲雙胍抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

郭娜1逄曙光

(章丘市人民醫(yī)院輸血科，山東章丘250200)

摘要〔〕目的探討二甲雙胍對(duì)人大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)法評(píng)估暴露于晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)(100 μg/ml)和二甲雙胍(10 mmol/L)后，SW480細(xì)胞存活率；采用碘化丙啶(PI)染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；采用Annexin V和PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；應(yīng)用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力；應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin和Vimentin的表達(dá)。結(jié)果在AGEs預(yù)處理的SW480細(xì)胞，二甲雙胍抑制其增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡；二甲雙胍也降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和EMT，增加E-cadherin蛋白表達(dá)、降低Vimentin蛋白表達(dá)。結(jié)論二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞顯示了抗腫瘤效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制EMT過(guò)程有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕大腸癌；二甲雙胍；晚期糖基化終末產(chǎn)物；糖尿病；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R735.3+4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助(81170771，81270175)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2012GSF11803)；濟(jì)南市國(guó)際合作計(jì)劃項(xiàng)目(201011008)

通訊作者：逄曙光(1966-)，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌病研究。

1山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院

第一作者：郭娜(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌病研究。

Decreased invasion and epithelial mesenchymal transition in AGEs induced colorectal cancer cells by Metformin

GUO Na, PANG Shu-Guang.

Zhangqiu Municipal People's Hospital, Zhangqiu 250200, Shandong, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Metformin on the proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human colorectal cancer (CRC) cells.MethodsMTT assay was used to assess viability of SW480 cells after exposure to advanced glycation end-products (AGEs) (100 μg/ml) and metformin (10 mmol/L). Cell cycle analysis was performed by Propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining. Transwell migration assays was performed to assess cell invasion. The expressions of E-cadherin and Vimentin were detected by Western blot.ResultsMetformin decreased proliferation, induced cell cycle arrest in G0/G1 phase and enhanced apoptosis. Metformin also decreased cell invasion and EMT induced by AGEs treatment, which was evidenced by increasing E-cadherin protein expression and decreasing Vimentin protein expression.ConclusionsMetformin has effects on proliferation, cell cycle, apoptosis, invasion, and EMT of human CRC cells induced by AGEs.

【Key words】Colorectal cancer (CRC); Metformin; Advanced glycation end-products (AGEs); Diabetes mellitus; Epithelial-mesenchymal transition (EMT)

大腸癌(CRC)患者的死亡主要是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移造成的，特別是在晚期腫瘤。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是指蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子自發(fā)與葡萄糖或其他還原單糖在沒(méi)有酶參與的條件下反應(yīng)生成的穩(wěn)定的共價(jià)加成物，與糖尿病的慢性并發(fā)癥密切相關(guān)〔1〕。二甲雙胍是一種胰島素增敏劑，用于降低胰島素抵抗性和恢復(fù)胰島素敏感性〔2〕。在前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中，二甲雙胍具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)〔3〕。應(yīng)用二甲雙胍治療糖尿病患者，其CRC的發(fā)病率顯著降低〔4〕。但在CRC中，二甲雙胍的抗腫瘤作用是否通過(guò)AGEs誘導(dǎo)的病理機(jī)制發(fā)揮作用還不清楚。本研究擬探討二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)處理的CRC細(xì)胞的作用及其機(jī)制，以期為CRC的治療提供新的思路和方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑人CRC細(xì)胞株SW480購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。AGEs，二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清由杭州四季青生物工程公司生產(chǎn)。DMEM(高糖)為美國(guó)Gibco產(chǎn)品。小鼠抗人E-cadherin，Vimentin和β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠第二抗體，均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。Matrigel膠購(gòu)自BD Biosciences 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將SW480細(xì)胞以(2～4)×105/ml密度接種于含10%胎牛血清(FBS)的高糖型DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中同時(shí)補(bǔ)充有100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺。培養(yǎng)置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。用0.25%胰酶消化生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后的細(xì)胞，含10%胎牛血清的DMEM配成細(xì)胞懸液，以2×104/ml濃度接種于96孔或24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μl DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)過(guò)夜后如細(xì)胞貼壁良好，換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使其生長(zhǎng)同步化，然后加入AGEs(100 μg/ml)處理。正常對(duì)照組為SW480細(xì)胞加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3細(xì)胞增殖試驗(yàn)用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶間接反映活細(xì)胞數(shù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞以2×105細(xì)胞/ml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，加入AGEs(100 μg/ml)預(yù)處理，然后加入二甲雙胍(10 mmol/L)，培養(yǎng)12、24、48、72 h后取細(xì)胞測(cè)細(xì)胞活力。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、暗處孵育4 h后，離心3 000 r/min、10 min，使藍(lán)紫色產(chǎn)物formazan沉淀下來(lái)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，置于37℃充分溶解后，在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)定OD值。

1.4細(xì)胞周期應(yīng)用碘化丙啶(PI)染色分析DNA含量來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使其生長(zhǎng)同步化。然后以2×104/ml濃度接種于24孔培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、AGEs組、二甲雙胍組和AGEs+二甲雙胍組。培養(yǎng)24 h后，每組收集(1～2)×106細(xì)胞，離心3 000 r/min，5 min。PBS液洗滌后，邊震蕩沉淀細(xì)胞，邊加入75%乙醇，放置于4℃固定24 h。PBS再洗滌1次，離心后，加PI溶液(PI終濃度50 μg/ml；RNaseA終濃度0.5 mg/ml)，放置于室溫，暗處15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5細(xì)胞凋亡用Annexin V-FITC和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每組收集2×105細(xì)胞，離心3 000 r/min，5 min。PBS洗滌后用100 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加2.5 μl Annexin V和5 μl PI(終濃度10 μg/ml)，暗處放置15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6細(xì)胞侵襲試驗(yàn)采用Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480細(xì)胞的侵襲能力。Transwell小室的下室加入500 μl培養(yǎng)液，加100 μl SW480細(xì)胞懸液于Transwell小室的上室。培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用乙醇常規(guī)固定濾膜，錐蟲(chóng)藍(lán)染色。穿過(guò)濾膜的細(xì)胞多數(shù)黏附在濾膜下表面，因此用棉簽拭去濾膜上室面的細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel膠細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3復(fù)孔。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)定無(wú)Matrigel膠的孔作為空白組，以空白組的穿膜細(xì)胞數(shù)為分母，各實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)為分子，得到的百分率作為癌細(xì)胞體外侵襲指數(shù)。

1.7免疫印跡分析收獲細(xì)胞后，用PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，收集所有細(xì)胞后離心，用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每孔取50 μg總蛋白與蛋白上樣緩沖液混合后煮沸5 min。蛋白上樣后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，恒壓電泳約2 h。再以100 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TTBS緩沖液封閉2 h，洗膜，加入小鼠抗人E-cadherin和Vimentin單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的兔抗小鼠第二抗體(1∶1 000)，室溫震蕩孵育1 h，加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，膠片經(jīng)曝光、顯影、定影和晾干后，進(jìn)行圖形處理及半定量分析。應(yīng)用圖形軟件對(duì)特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以E-cadherin或Vimentin蛋白對(duì)β-actin蛋白的灰度比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1二甲雙胍抑制AGEs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組相比，AGEs處理能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，增加各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力。單獨(dú)加入二甲雙胍不影響細(xì)胞活力。然而，在AGEs預(yù)處理的細(xì)胞中，加入二甲雙胍能顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1　二甲雙胍抑制AGEs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞增殖

2.2二甲雙胍對(duì)CRC細(xì)胞周期的影響SW480細(xì)胞與AGEs(100 μg/ml)和(或)二甲雙胍(10 mmol/L)共同孵育24 h。AGEs處理降低G0/G1期比例，增加S期比例。二甲雙胍增加AGEs預(yù)處理CRC細(xì)胞G0/G1期比例，減少S期比例(P<0.05)。然而，AGEs和二甲雙胍均不影響G2/M期細(xì)胞的比例，見(jiàn)圖2。

圖2　二甲雙胍抑制AGEs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞周期 阻滯于G 0/G 1期

2.3二甲雙胍對(duì)CRC細(xì)胞凋亡的影響AGEs本身不會(huì)引起SW480細(xì)胞凋亡率的變化(凋亡指數(shù)，對(duì)照組7.46±1.14，AGEs組6.44±1.38)。然而，二甲雙胍處理不僅增加SW480細(xì)胞凋亡(凋亡指數(shù)12.13±1.91)，也增加AGEs預(yù)處理的SW480細(xì)胞凋亡〔凋亡指數(shù)(25.27±4.00)〕(P<0.05)。此外，在AGEs預(yù)處理的SW480細(xì)胞，加入二甲雙胍后顯示了比單獨(dú)二甲雙胍處理更高的凋亡率。

2.4二甲雙孤抑制AGE誘導(dǎo)的腫瘤侵襲和EMTAGEs可顯著提高SW480細(xì)胞侵襲指數(shù)(AGE組：64.3±7.2，對(duì)照組：31.1±5.8)。二甲雙胍處理能顯著降低AGEs誘導(dǎo)的侵襲指數(shù)(35.0±4.3)。然而，與對(duì)照細(xì)胞相比，二甲雙胍單獨(dú)處理的SW480細(xì)胞沒(méi)有顯示侵襲指數(shù)的顯著差異(24.9±4.5)。

免疫印跡結(jié)果顯示，二甲雙胍處理能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的EMT，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)增加，Vimentin蛋白表達(dá)降低。然而，與對(duì)照SW480細(xì)胞相比，二甲雙胍單獨(dú)處理對(duì)兩個(gè)EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。見(jiàn)表1。

表1　二甲雙胍抑制AGEs誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與AGEs組比較：2)P<0.05

3討論

在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)CRC細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)，能抑制AGEs預(yù)處理的SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。二甲雙胍處理也能抑制腫瘤的侵襲和EMT，表現(xiàn)為上皮來(lái)源的E-cadherin蛋白表達(dá)增加和間質(zhì)來(lái)源的Vimentin蛋白降低。

大量流行病學(xué)調(diào)查顯示了糖尿病和CRC之間的正相關(guān)，糖尿病本身成為CRC發(fā)病的危險(xiǎn)因素〔5〕。在無(wú)癥狀個(gè)體中，很多升高的糖代謝標(biāo)志，如血糖水平、HOMA值、HbA1c和C肽水平以及代謝綜合征，都與大腸腺瘤的流行呈顯著正相關(guān)〔6〕。

AGEs是由還原糖，如葡萄糖與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸的氨基基團(tuán)形成的酶促反應(yīng)形成產(chǎn)物。AGEs通過(guò)與相應(yīng)受體RAGE結(jié)合而發(fā)揮促炎癥反應(yīng)作用。在正常人血液中可以檢出可溶性RAGE，它們能與AGEs結(jié)合，從而避免與組織RAGE結(jié)合，起到保護(hù)作用。AGEs和RAGE在許多組織和細(xì)胞中表達(dá)，并與一些代謝性、神經(jīng)退行性和炎癥性疾病如糖尿病的發(fā)病相關(guān)〔7〕。最近，AGEs和RAGE被發(fā)現(xiàn)與一些腫瘤有關(guān)〔8〕。糖尿病患者CRC的發(fā)病率顯著升高〔9〕。在男性吸煙者，高水平的血清可溶性RAGE與較低的CRC發(fā)病率相關(guān)〔10〕。AGEs能增強(qiáng)大鼠結(jié)腸黏膜 RAGE的表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展〔11〕。因此在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們把AGEs作為誘導(dǎo)劑體外處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AGEs能促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖，與其他作者最近報(bào)道AGEs通過(guò)提高碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果相符合〔12〕。

二甲雙胍廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病〔13〕，能抑制能量敏感的AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖〔14〕。二甲雙胍顯示了廣泛的抗腫瘤效應(yīng)，如抑制乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌的增殖〔15〕。我們的結(jié)果也顯示了二甲雙胍對(duì)CRC細(xì)胞的抑制增殖作用，其機(jī)制可能與二甲雙胍誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還能抑制CRC細(xì)胞侵襲和EMT過(guò)程。

CRC患者的死亡主要來(lái)自于癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，原位癌細(xì)胞向轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個(gè)由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程，伴隨著細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。而EMT是這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔16〕。二甲雙胍在許多腫瘤中能抑制EMT過(guò)程〔17〕，其機(jī)制可能與二甲雙胍激活的下游信號(hào)分子AMPK有關(guān)〔18〕。我們首次發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍抑制CRC細(xì)胞的EMT過(guò)程可能是其抑制CRC細(xì)胞侵襲的重要原因。

總之，二甲雙胍能對(duì)AGEs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞侵襲和EMT。由于二甲雙胍對(duì)AGEs預(yù)處理的CRC細(xì)胞顯示了更強(qiáng)的抑制侵襲和EMT的作用，我們推測(cè)，二甲雙胍對(duì)CRC的抗腫瘤效應(yīng)可能是通過(guò)干擾AGEs在CRC細(xì)胞誘導(dǎo)的病理機(jī)制而起作用。應(yīng)用二甲雙胍將成為糖尿病相關(guān)CRC的一種治療策略。

4參考文獻(xiàn)

1Singh VP，Bali A，Singh N，etal.Advanced glycation end products and diabetic complications〔J〕.Korean J Physiol Pharmacol,2014；18(1)：1-14.

2Karnevi E，Said K，Andersson R，etal.Metformin-mediated growth inhibition involves suppression of the IGF-I receptor signalling pathway in human pancreatic cancer cells〔J〕.BMC Cancer,2013；13：235.

3Demir U，Koehler A，Schneider R，etal.Metformin anti-tumor effect via disruption of the MID1 translational regulator complex and AR downregulation in prostate cancer cells〔J〕.BMC Cancer,2014；14(1)：52.

4Zhang ZJ，Zheng ZJ，Kan H，etal.Reduced risk of colorectal cancer with metformin therapy in patients with type 2 diabetes：a meta-analysis〔J〕.Diabetes Care,2011；34(10)：2323-8.

5Sun L，Yu S.Diabetes mellitus is an independent risk factor for colorectal cancer〔J〕.Dig Dis Sci,2012；57(6)：1586-97.

6Rampal S，Yang MH，Sung J，etal.Association between markers of glucose metabolism and risk of colorectal adenoma〔J〕.Gastroenterology,2014；147(1)：78-87，e3.

7Bierhaus A，Nawroth PP.Multiple levels of regulation determine the role of the receptor for AGE (RAGE)as common soil in inflammation，immune responses and diabetes mellitus and its complications〔J〕.Diabetologia,2009；52(11)：2251-63.

8Logsdon CD，F(xiàn)uentes MK，Huang EH，etal.RAGE and RAGE ligands in cancer〔J〕.Curr Mol Med,2007；7(8)：777-89.

9Abe R，Yamagishi S.AGE-RAGE system and carcinogenesis〔J〕.Curr Pharm Des,2008；14(10)：940-5.

10Jiao L，Taylor PR，Weinstein SJ，etal.Advanced glycation end products，soluble receptor for advanced glycation end products，and risk of colorectal cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2011；20(7)：1430-8.

11Shimomoto T，Luo Y，Ohmori H，etal.Advanced glycation end products (AGE)induce the receptor for AGE in the colonic mucosa of azoxymethane-injected Fischer 344 rats fed with a high-linoleic acid and high-glucose diet〔J〕.J Gastroenterol,2012；47(10)：1073-83.

12Chen H，Wu L，Li Y，etal.Advanced glycation end products increase carbohydrate responsive element binding protein expression and promote cancer cell proliferation〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2014；395(1-2)：69-78.

13Ballav C，Gough SC.Safety and efficacy of sitagliptin-metformin in fixed combination for the treatment of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Clin Med Insights Endocrinol Diabetes,2013；6(1)：25-37.

14Zakikhani M，Dowling R，F(xiàn)antus IG，etal.Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2006；66(21)：10269-73.

15Rattan R，Graham RP，Maguire JL，etal.Metformin suppresses ovarian cancer growth and metastasis with enhancement of cisplatin cytotoxicity in vivo〔J〕.Neoplasia,2011；13(5)：483-91.

16Todosi AM，Gavrilescu MM，Anitei GM，etal.Colon cancer at the molecular level-usefulness of epithelial-mesenchymal transition analysis〔J〕.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,2012；116(4)：1106-11.

17Barrière G，Tartary M，Rigaud M.Metformin：a rising star to fight the epithelial mesenchymal transition in oncology〔J〕.Anticancer Agents Med Chem,2013；13(2)：333-40.

18Chou CC，Lee KH，Lai IL，etal.AMPK reverses the mesenchymal phenotype of cancer cells by targeting the Akt-MDM2-Foxo3a signaling axis〔J〕.Cancer Res,2014；74(17)：4783-95.

〔2014-01-23修回〕

(編輯李相軍)