白細(xì)胞介素2和6對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D的調(diào)節(jié)

孫超唐瑞峰白建國(guó)田貴金苑建磊齊帥

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北石家莊050011)

摘要〔〕目的探討白細(xì)胞介素(IL)-2和IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-D的調(diào)節(jié)。方法采用由IL-2或IL-6分別對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402進(jìn)行刺激，采取逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)觀察其VEGF-D基因表達(dá)。結(jié)果IL-2使細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402產(chǎn)生VEGF-D mRNA減少；IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果，但是無法從作用時(shí)間上來顯著判斷。IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果，當(dāng)濃度條件滿足情況下，促進(jìn)作用和作用時(shí)間存在正相關(guān)。結(jié)論抑制肝癌細(xì)胞VEGF-D mRNA的表達(dá)方面，IL-2作用比較明顯，對(duì)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移能夠形成一定作用；肝癌細(xì)胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá)方面，IL-6帶來的促進(jìn)效果明顯，但是對(duì)肝癌作用需更多研究。

關(guān)鍵詞〔〕肝癌；白細(xì)胞介素2；白細(xì)胞介素6；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號(hào)〔〕R735.7〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

項(xiàng)目基金

通訊作者：唐瑞峰(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝膽疾病研究。

第一作者：孫超(1983-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝膽疾病研究。

原發(fā)性肝癌臨床癥狀出現(xiàn)晚，通過手術(shù)的方式來切除的可能性很低，且預(yù)后情況不良。癌細(xì)胞的活躍性與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族之間存在緊密的關(guān)系。作為VEGF家族的一員，VEGF-D體內(nèi)表達(dá)分兩種：一是正常表達(dá)，二是腫瘤細(xì)胞的異常表達(dá)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移形成密切關(guān)系。細(xì)胞因子對(duì)VEGF家族成員表達(dá)形成影響，而常見的炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6作用較明顯。本研究探討IL-2和IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株VEGF-D基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，分析肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移效應(yīng)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)、刺激、分組及總RNA的提取細(xì)胞培養(yǎng)：無菌、37℃，濕度為含5%CO2的飽和狀態(tài)；培養(yǎng)基RPMI1640，第一階段要求內(nèi)部AMV逆轉(zhuǎn)錄酶+逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，溫度42℃，時(shí)長(zhǎng)60 min；第二階段是將cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+VEGF-D正反義引物，劑量均為2.5 μl，總反應(yīng)體系為20 μl，SMMC-7721和BEL-7402。刺激：①人肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇-傳代-穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，將10%胎牛血清更換成0.1%胎牛血清，型號(hào)不變，持續(xù)培養(yǎng)12 h，主要目的是避免血清與細(xì)胞增殖之間的不良作用。分組：刺激12 h后，培養(yǎng)液繼續(xù)調(diào)整作為分組依據(jù)，實(shí)驗(yàn)組分兩種培養(yǎng)液，一是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-2 0.1%胎牛血清，二是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-6 0.1%胎牛血清。培養(yǎng)3、6、12、24 h。對(duì)照組：刺激后，實(shí)驗(yàn)組中的兩種培養(yǎng)液添加磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)，要求劑量一致?？俁NA的提?。憾〞r(shí)獲得細(xì)胞，刺激方法是Trizol一步法，總RNA提取包括刺激前后兩個(gè)時(shí)間段。

1.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)反應(yīng)材料：第一階段，RNA 2 μl+AMV逆轉(zhuǎn)錄酶+逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，溫度控制在42℃，時(shí)長(zhǎng)控制在60 min；第二階段是將cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+VEGF-D正反義引物，劑量2.5 μl，總反應(yīng)體系為20 μl，先溫度控制在95℃，實(shí)現(xiàn)預(yù)變性5min，再控制溫度為94℃，變性45 s，55℃退火45 s，72℃持續(xù)1 min 30 s，循環(huán)40次，再控制溫度72℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為5 min；而針對(duì)cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+β-actin正反義引物，劑量2.5 μl，總反應(yīng)體系為20 μl：先溫度控制在95℃，實(shí)現(xiàn)預(yù)變性5 min，再控制溫度為94℃，變性30 s，55℃退火30 s，72℃持續(xù)30 s，循環(huán)35次，再控制溫度72℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為5 min；PCR技術(shù)應(yīng)用于擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定。產(chǎn)物先后需要電泳、染色，再進(jìn)行掃描(凝膠型)分析，其中電泳使用1.5%普通瓊脂糖凝膠、染色采取溴乙啶，實(shí)現(xiàn)DNA電泳條帶掃描和光量子強(qiáng)度處理，將VEGF-D與β-actin比值作為表達(dá)水平的參照，對(duì)VEGF-D產(chǎn)物相對(duì)定量。VEGF-D上游引物：5' AGC TGG GGA AGA GTA CCA ACA 3'，下游引物：5' CAC AGA GAG CTG GTT CCT GGA 3'，對(duì)應(yīng)生成一個(gè)422個(gè)堿基的基因片段。β-actin上游引物：5' TGA GAC CTT CAA CAC CCC AG 3'，下游引物：5' GCC ATC TCT TGC TCG AAG TC 3'，對(duì)應(yīng)生成一個(gè)316個(gè)堿基的基因片段。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

IL-2抑制肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA的表達(dá)，濃度及作用時(shí)間不存在相關(guān)性。見圖1。IL-2抑制肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá)，并在0.1～100 μg/L范圍內(nèi)隨濃度的增加，抑制作用逐步增強(qiáng)，但與作用時(shí)間不存在相關(guān)性。見圖2。IL-6與肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果，但與作用時(shí)間不存在顯著相關(guān)。見圖3。IL-6與肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果，當(dāng)濃度條件滿足情況下，促進(jìn)作用和作用時(shí)間存在正相關(guān)。見圖4。

1.對(duì)照組;2.0.1 μg/L;3.1 μg/L;4.10 μg/L;5.100 μg/L;6.200 μg/L；下圖同 圖1　IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7402表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

圖2　IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7721表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

圖3　IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7402表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

圖4　IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7721表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

3討論

原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)，主要是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移為主。人VEGF-D在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生方面產(chǎn)生的促進(jìn)效果表現(xiàn)出了特異性，如淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移方面均存在相關(guān)性。研究〔1，2〕表明，VEGF-D與肝癌及胰腺癌表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)性，對(duì)于這些腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等表現(xiàn)出來的生物學(xué)行為存在相關(guān)性。IL-2可抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移，主要限制胰腺癌細(xì)胞VEGF-D mRNA表達(dá)，而IL-6對(duì)于某些胰腺癌細(xì)胞VEGF-D mRNA表達(dá)也有促進(jìn)效果。

“細(xì)胞因子對(duì)于惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展”的研究證明部分細(xì)胞因子是能夠產(chǎn)生重要效果的〔3，4〕。此類細(xì)胞因子表現(xiàn)出來的介質(zhì)作用對(duì)癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞形成一個(gè)相互作用的機(jī)制，這種作用機(jī)制下，出現(xiàn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移到身體其他部位，如淋巴等產(chǎn)生的影響作用很重要。缺氧，K-ras、p53基因的突變、VHL基因產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-B、轉(zhuǎn)錄因子如缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和sp1等這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子都可以產(chǎn)生誘導(dǎo)效果。而新生血管的形成方面，細(xì)胞因子IL-1、IL-6等通過對(duì)上述家族的表達(dá)誘導(dǎo)，是可以產(chǎn)生這種效果的〔5～7〕。Salven 等〔8〕證實(shí)：IL-1α對(duì)炎癥細(xì)胞的誘導(dǎo)，能夠在VEGF-A實(shí)現(xiàn)血管新生；Cohen等〔9〕證實(shí)：IL-6對(duì)腫瘤細(xì)胞株可在刺激狀況下，形成VEGF-A；Huang等〔10〕證實(shí)：IL-6在胃癌VEGF-A的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生癌組織新生血管；Wei等〔11〕證實(shí)：IL-6激活VEGF-A能夠促進(jìn)頸部腫瘤的新生血管生長(zhǎng)。唐瑞峰等〔12〕證實(shí)：IL-1α和IL-6因誘導(dǎo)促進(jìn) VEGF-A和C產(chǎn)生，作為一種調(diào)節(jié)因子作用于胰腺癌細(xì)胞。

IL-2在免疫治療或腫瘤生物治療方面已經(jīng)得到重視和具有廣泛的使用率〔13〕。報(bào)道〔14，15〕顯示，IL-2受體在腫瘤細(xì)胞表面上具有明顯的相互關(guān)系，這種相互結(jié)合(IL-2與受體)的情況下，限制腫瘤細(xì)胞繼續(xù)發(fā)展。本研究表明IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖可以產(chǎn)生明顯的限制效果，甚至可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞在形成VEGF-D方面來實(shí)現(xiàn)抑制作用。

IL-6的功能開發(fā)已經(jīng)得到了非常廣泛的程度〔16〕，表現(xiàn)出來的生物活性作為關(guān)鍵因子，在機(jī)體細(xì)胞因子中占據(jù)了重要地位，表現(xiàn)最活躍的是在造血系統(tǒng)、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)方面。該因子的特性是不僅直接對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行作用，還可以對(duì)周邊細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的生存環(huán)境進(jìn)行改變，進(jìn)而間接作用于腫瘤細(xì)胞，同時(shí)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激或抑制作用方面，IL-6都表現(xiàn)出明顯的雙面性效果，分析其原因是IL-6跟靶細(xì)胞特性相關(guān)聯(lián)。Strassmann等〔17〕研究顯示，IL-6在促進(jìn)腫瘤病情惡化方面，是通過腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)調(diào)節(jié)來產(chǎn)生的。IL-6也與腫瘤抗體的免疫情況有關(guān)，也表現(xiàn)出了腫瘤細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)性很顯著。IL-6水平與腫瘤臨床分期有關(guān)，隨著分期的時(shí)間推移，腫瘤的負(fù)荷程度就越大，IL-6水平與之呈正相關(guān)，從腫瘤病情來說，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期病患血清IL-6水平表現(xiàn)出很高的水平，而無轉(zhuǎn)移病患則很低；治療效果與血清IL-6水平呈負(fù)相關(guān)。本研究中IL-6的促進(jìn)效果表明，該因子能夠讓肝癌細(xì)胞形成VEGF-D，并引發(fā)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移。抑制肝癌細(xì)胞VEGF-D mRNA的表達(dá)方面，IL-2作用比較明顯，對(duì)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移能夠形成一定作用。肝癌細(xì)胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá)方面，IL-6帶來的促進(jìn)效果明顯，但是對(duì)肝癌作用需更多研究。

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〔2014-07-19修回〕

(編輯苑云杰)