艾灸對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜病變的影響

江星孫志嶺周丹萍徐驍王苗苗王富強1許志洋1紀偉2

(南京中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，江蘇南京210023)

摘要〔〕目的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察艾灸對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜病變的影響。方法48只雄性SD大鼠，隨機選取6只作為正常組，余42只建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，其中造模成功的36只隨機分為6組：艾灸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6只。艾灸組選取雙側(cè)“足三里”、“腎俞”穴治療，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別干預(yù)1、2、3 w。模型組不治療。7組大鼠分別收集滑膜組織標本，雙向電泳。軟件分析比對各時間點艾灸組、模型組以及正常組。選取各時間點模型組與艾灸組共同差異蛋白點，應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定，IPA軟件分析差異蛋白的生物功能、信號通路及信號網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果①成功建立了各組關(guān)節(jié)滑膜雙向凝膠電泳圖譜。②發(fā)現(xiàn)并鑒定各時間點艾灸組與模型組共同差異蛋白質(zhì)9個，PRDXⅠ，EHHADH，MLC3，HPX等蛋白主要通過自身變化調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化通路Ⅲ、NRF2-介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路、急性期反應(yīng)通路、細胞骨架肌動蛋白通路、上皮細胞黏附通路等，從而參與功能涉及DNA復(fù)制、重組和修復(fù)、細胞集結(jié)和炎性反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)，最終調(diào)控本研究中RA的發(fā)生與發(fā)展。結(jié)論PRDXⅠ，EHHADH，MLC3，HPX等蛋白具有潛在的作為艾灸治療RA靶點或療效標志物的意義，為進一步研究艾灸作用機制提供蛋白質(zhì)組學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕艾灸；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜；滑膜

中圖分類號〔〕R593.22〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81173158)；江蘇省高校自然科學(xué)

通訊作者：孫志嶺(1970-)，男，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療風(fēng)濕病學(xué)研究。

1南京醫(yī)科大學(xué)大型儀器中心2江蘇省中醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

第一作者：江星(1983-)，女，碩士，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療風(fēng)濕病學(xué)研究。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜病變、骨質(zhì)侵蝕為主要特征，其病理特點是關(guān)節(jié)滑膜的反復(fù)慢性炎性反應(yīng)、血管翳形成，由此引起軟骨吸收、骨質(zhì)破壞和骨纖維化〔1，2〕。本研究應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)及質(zhì)譜比較艾灸干預(yù)后不同時間點的共同差異蛋白，并進行IPA分析，旨在尋找艾灸治療RA目的蛋白及其信號通路與信號網(wǎng)絡(luò)，探究艾灸療法作用機制。

1材料與方法

1.1實驗場所與動物本實驗在南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心完成。SPF級飼養(yǎng)條件：自由滅菌飲食、光/暗周期12 h/12 h(光照時間06：00～18：00)、背景噪音(40±10)db、溫度(20±3)℃、相對濕度40%～50%。健康、雄性Sarague-Dawley(SD)大鼠48只，SPF級，體重200～250 g，購于北京維通利華動物實驗中心〔SCXK (京) 2012-0001〕。

1.2主要試劑與儀器純乙酸、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex公司；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酞胺(Iodoacetmaide)、丙烯酞胺(Acrylmaideine)、甲叉雙丙烯酞胺(Disacylmaide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-〔(3-膽酰胺丙基)-二乙胺〕-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、硫代硫酸鈉、瓊脂糖、固相pH梯度干膠條IPG strip(pp～10 NL，24 cm)、固相pH梯度膠條緩沖液(IPGB，Pp～10 NL)等購自美國Amersham公司。

IPG phor等電聚焦儀，Ettan Dalt Ⅱ垂直電泳系統(tǒng)、Image Master 2D 5.0圖像分析軟件均為美國Amersham公司產(chǎn)品?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOF/TOF-MS：Ultraflex Ⅱ型)為德國Bruker公司產(chǎn)品。

1.3施灸材料無煙艾灸選擇南陽萬春堂天然艾草生物制品開發(fā)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：7 mm×12 mm。

1.4方法

1.4.1動物模型制備、實驗分組及艾灸方法SD大鼠48只，按隨機數(shù)字表法分出6只為正常組，42只建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。參照文獻〔3〕方法，牛Ⅱ型膠原溶解在0.05 mol/L的醋酸中，配制成2 mg/ml的膠原溶液，4℃過夜。冰浴條件下，用樣本均質(zhì)儀低速混合時滴加等體積的完全弗氏佐劑，配制Ⅱ型膠原乳劑(終濃度為1 mg/ml)。以每只200 μl于鼠尾根部皮下注射免疫，7 d后按照上述方法100 μl鼠尾基部皮內(nèi)注射二次免疫。納入實驗的42只大鼠有8只造模失敗，造模成功的36只大鼠隨機分為6組，艾灸Ⅰ組，艾灸Ⅱ組，艾灸Ⅲ組，模型Ⅰ組，模型Ⅱ組，模型Ⅲ組，每組6只。

參考文獻各組大鼠均定穴剃毛，捆縛于鼠板?！?〕，艾灸組取大鼠腎俞穴(第二腰椎棘突下，左右旁開7 mm)和足三里穴(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處)，點燃的無煙艾條垂直固定在灸架上保持與穴位距離2 cm (施灸過程中統(tǒng)一按照腎俞穴-對側(cè)腎俞穴-足三里-對側(cè)足三里的順序)，每穴灸20 min。Ⅰ組干預(yù)1 w，Ⅱ組干預(yù)2 w，Ⅲ組干預(yù)3 w。

1.4.2滑膜組織預(yù)處理每組干預(yù)結(jié)束后，大鼠處死剝離膝關(guān)節(jié)滑膜，迅速放入液氮凍存。同組滑膜組織等量混合，按約1∶8(m/V)的比例加入組織裂解液〔7 mol/L Urea、2 mol/L Lhtiourea，2% Pharmalyte(pp～10)，2% NP-40，1% Triton X-100，0.5 mmol/L EDTA，40 mmol/L Tris，4%CHAPS，100 mmol/L DTT，5 mmol/L PMSF〕。室溫下靜置孵育1 h，其間每隔15 min渦旋一次×3 s，然后以1 200 r/min，4℃離心1 h，吸取上清即為組織中的總蛋白質(zhì)。取少許(1 μl)組織總蛋白用Bradford法測蛋白質(zhì)濃度，其余上清分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳按IPGphor等電聚焦系統(tǒng)指南及Sun等〔5〕的方法設(shè)IPGphor 儀器運行參數(shù)：設(shè)置程序水化和聚焦均在20℃下進行，電流為每根膠條7 μA，總電壓時間69 920 Vh，其中水化在30 V低電壓下進行1 h，然后經(jīng)過500 V 1 h、1 000 V 1 h，最后穩(wěn)定在8 000 V等電聚焦8.5 h。等電聚焦后，取出膠條于平衡緩沖液中平衡2次，平衡后在12.5%SDS-PAGE均勻膠上行第二向電泳。銀染染色，每份蛋白樣品均重復(fù)電泳3次。

1.4.4凝膠蛋白圖譜分析應(yīng)用Image Scanner掃描儀進行掃描，Image Master 2D 5.0軟件進行包括蛋白點的檢測、量化、背景扣除和點的匹配等圖像分析。以正常組滑膜蛋白作為對照，將艾灸組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)與模型組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)對應(yīng)比較，計算蛋白變化量的比值，以比值>1.2〔6〕或<0.83〔7〕的點以及是有或無差別的蛋白點作為后續(xù)質(zhì)譜鑒定及IPA分析的候選蛋白點。

1.4.5質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫查詢需鑒定的差異蛋白點經(jīng)切割、脫色、還原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取及脫鹽后，利用質(zhì)譜儀測得各自肽質(zhì)量指紋圖譜，并以基質(zhì)峰、酶自動降解片段峰進行校正。所得肽質(zhì)量指紋圖譜用Mascot搜索引擎檢索NCBI、MSDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。參數(shù)設(shè)置為每個肽允許有1個不完全裂解位點，且肽片段分子量最大容許誤差為±100 ppm，蛋白質(zhì)匹配分數(shù)>54分，物種來源為大鼠。

1.4.6差異蛋白的生物信息學(xué)分析采用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)軟件分析經(jīng)鑒定的差異蛋白質(zhì)的生物功能、信號通路，并繪制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)圖。

2結(jié)果

2.1雙向凝膠電泳分析結(jié)果各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳銀染圖譜清晰，蛋白質(zhì)點分離完全，每張血清凝膠圖

譜辨識(1 316.7±24.7)個蛋白點，并顯示良好重復(fù)性與穩(wěn)定性。經(jīng)過背景消減后，分別將其中一塊凝膠作為參考膠進行3塊凝膠間的蛋白質(zhì)點匹配，組內(nèi)蛋白點平均匹配率90%～93%。比對后發(fā)現(xiàn)，模型Ⅰ組與艾灸Ⅰ組有365個差異點；模型Ⅱ組與艾灸Ⅱ組有332個差異點；模型Ⅲ組與艾灸Ⅲ組有202個差異點。選取三個時間點共同表達的9個差異蛋白點，作為艾灸治療持續(xù)變化及發(fā)揮作用的差異蛋白。這9個蛋白質(zhì)點在2-DE凝膠上的具體位置見圖1。用蛋白點的灰度值代表蛋白表達豐度進行不同時間點差異蛋白點(Spot 1～9)的組間定量比較結(jié)果見表1。

2.2部分差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定根據(jù)2-DE結(jié)果，獲得9張肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，進入Matrix Science Mascot檢索界面，9個共同表達的差異蛋白具體名稱和相關(guān)信息見表2。

圖1　9個共同差異蛋白點在凝膠上的具體位置

SpotNo.正常組艾灸Ⅰ組模型Ⅰ組艾灸Ⅱ組模型Ⅱ組艾灸Ⅲ組模型Ⅲ組10.0000±0.000000.0879±0.006580.1400±0.008590.0000±0.000000.0362±0.010570.0152±0.013300.0639±0.0121220.0820±0.018260.2038±0.003450.1485±0.005500.1755±0.035800.2567±0.019640.0899±0.020760.1590±0.0261830.6041±0.047730.2961±0.008680.2014±0.012690.4886±0.091080.3127±0.042780.5331±0.032240.9268±0.0241240.3101±0.038930.0659±0.013900.0362±0.006950.1931±0.040520.0988±0.012280.2235±0.010070.3592±0.0393750.0146±0.004220.0198±0.004800.0304±0.002680.0028±0.004800.0221±0.006670.0153±0.005660.0285±0.0049160.1732±0.059280.3737±0.046140.2340±0.026940.3033±0.011120.3703±0.039820.2007±0.027850.2996±0.0323870.0398±0.010170.0607±0.013060.0334±0.006550.0429±0.009960.0804±0.005640.0265±0.006870.0562±0.0019080.2393±0.032550.1595±0.011630.0494±0.022220.1551±0.023790.2643±0.038210.0514±0.045530.1428±0.0335990.0000±0.000000.0131±0.011930.0643±0.013900.0000±0.000000.0344±0.012060.0333±0.009960.0047±0.00813

表2　9個蛋白質(zhì)點具體名稱及相關(guān)信息

2.3差異蛋白的IPA分析結(jié)果9個差異表達蛋白，4個(DLG 5、TMEM 71、E3 ubiquitin-protein ligase、dihydrolipoyl dehydrogenase)由于未能檢索到對應(yīng)的鼠源性Uniport AC，1個(uncharacterized C6orf 163)未搜索到IPA數(shù)據(jù)，最終得到4個蛋白〔過氧化物還原酶(PRDX)Ⅰ、EHHADH、肌球蛋白輕鏈(MLC)3、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)〕的IPA分析結(jié)果，包括生物功能分析、信號通路分析及信號網(wǎng)絡(luò)分析。

2.3.1差異蛋白的生物功能分析結(jié)果表3列出IPA分析獲得的4個蛋白(PRDXⅠ、EHHADH、MLC3、HPX)與RA相關(guān)度較高的生物功能。

表3　IPA分析與RA相關(guān)度較高的生物功能

以-Log(P值)表示分析結(jié)果的富集度，-Log(P值)越大，富集程度越好，參與該項生物功能的蛋白就越多，反之越少

2.3.2差異蛋白的信號通路分析結(jié)果IPA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)31條信號通路，其中富集度最高的通路是脂肪酸β-氧化通路Ⅲ(Fatty Acidβ-oxidation Ⅲ)，其他與RA密切相關(guān)的通路有急性期反應(yīng)(Acute Phase Response Signaling)、上皮細胞黏附通路(Epithelial Adherens Junction Signaling)、細胞骨架肌動蛋白通路(Actin Cytoskeleton Signaling)等。見表4。

表4　IPA分析與RA相關(guān)度較高的信號通路

以-Log(P值)表示富集度，較高代表此類通路被大量啟用；Ratio是指此類通路的激活程度，較高代表此類通路激活程度大(信息傳遞頻繁、信息傳遞量大)

2.3.3差異蛋白的信號網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果通過IPA軟件分析，我們得到模型組與艾灸組共同差異蛋白參與的網(wǎng)絡(luò)信息圖——涉及DNA復(fù)制、重組和修復(fù)；細胞集結(jié)和炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。由圖2可以發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)信息圖由1個(EHHADH)上調(diào)與4個(PRDXⅠ、MLC3、HPX)下調(diào)的差異蛋白參與，其中PRDXⅠ在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白的相互作用最密切，提示在網(wǎng)絡(luò)通路中具有重要的作用。

圖2　差異蛋白信號網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，PRDXⅠ、EHHADH、MLC3、HPX蛋白全都有可能參與了造模后的改變，3個蛋白(PRDXⅠ、MLC3、HPX)參與了艾灸調(diào)控過程。IPA分析發(fā)現(xiàn)，這4個蛋白參與的所有生物功能中，與RA密切相關(guān)的主要有器官形態(tài)、骨骼肌肉功能、免疫功能、炎性反應(yīng)和疾病、血液系統(tǒng)功能、結(jié)締組織功能等。

PRDXⅠ是重要的過氧化物酶(Prxs)，能清除過氧化物，保護機體免受氧化損傷和參與信號傳導(dǎo)等重要生理功能〔8〕。有研究發(fā)現(xiàn)RA患者抗CCP水平與滑膜液中氧化活性指標(如MDA、MPO)呈正相關(guān)〔9〕，說明RA病變過程中氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組PRDXⅠ表達上調(diào)，推測由此導(dǎo)致的滑膜氧化應(yīng)激反應(yīng)是其持續(xù)炎癥的原因之一；艾灸后低表達，推測艾灸可能通過下調(diào)PRDXⅠ表達，調(diào)整氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡。有學(xué)者認為MLC經(jīng)調(diào)節(jié)與Ca2+的結(jié)合來調(diào)節(jié)肌肉收縮與舒張頻率〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)，當模型組MLC3與正常組相比下調(diào)時艾灸使其上調(diào)，當MLC3與正常組相比上調(diào)時艾灸則使其下調(diào)，很顯然艾灸對MLC3在肌肉收縮過程中的調(diào)控起著非常重要的雙向調(diào)節(jié)作用。 HPX與血紅素結(jié)合能力最強，它最重要的功能是結(jié)合并轉(zhuǎn)運有毒的游離血紅素。研究提示〔12〕，HPX具備抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、器官保護等多種功能，并參與細胞分化以及細胞外基質(zhì)重建等生理過程。本研究顯示艾灸對模型組HPX表達水平有負反饋作用，提示艾灸在RA中顯示出明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。

本文發(fā)現(xiàn)EHHADH主要參與調(diào)控脂肪酸β-氧化通路Ⅲ，PRDX1主要參與調(diào)控NRF2-介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路等。提示造模使該通路激活，艾灸可能通過下調(diào)此通路緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和組織損傷。與RA密切相關(guān)的其他通路如細胞骨架肌動蛋白通路的激活驗證了RA病理過程中伴隨著軟骨侵蝕〔13〕，同時提示艾灸通過對此通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮調(diào)控HPX的關(guān)鍵作用。而急性期反應(yīng)、上皮細胞黏附功能的激活則是機體應(yīng)對炎癥時的一般反應(yīng)，同時炎癥也對此通路產(chǎn)生影響〔14〕，提示艾灸可能通過作用于這兩個通路發(fā)揮其干預(yù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，PRDXⅠ在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白的相互作用最密切，PRDXⅠ與LEP、UBC相鄰，LEP可與EHHADH及HPX聯(lián)系，UBC可與MLC3聯(lián)系，從而構(gòu)成了4個差異蛋白在整個信息網(wǎng)絡(luò)中的聯(lián)絡(luò)。提示PRDXⅠ在網(wǎng)絡(luò)通路中具有關(guān)鍵作用，處于信息網(wǎng)絡(luò)的核心位置。結(jié)合蛋白生物功能分析和信號通路分析結(jié)果，艾灸極有可能通過作用于NRF2-介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路下調(diào)PRDXⅠ，從而調(diào)節(jié)RA的發(fā)生與發(fā)展。

4參考文獻

1中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南〔J〕.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010;14(4)：265-70.

2Zhang Y，Guo Z，Zou L，etal.A comprehensive map and functional annotation of the normal human cerebrospinal fluid proteome〔J〕.J Proteomics，2015；119(1)：90-9.

3Cai X，Zhou H，Wong Y F，etal.Suppression of the onset and progression of collagen-induced arthritis in rats by QFGJS，a preparation from an anti-arthritic Chinese herbal formula〔J〕.J Ethnopharmacol，2007；110(1)：39-48.

4李忠仁.實驗針灸學(xué)〔M〕.第2版.北京：中國屮醫(yī)藥出版社，2007:255-7.

5Sun ZL，Zhu Y，Wang FQ，etal.Serum proteomic-based analysis of pancreatic carcinoma for the identification of potential cancer biomarkers〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007；1774(6)：764-71.

6Wu J，Wang F，Gong Y，etal.Proteomic analysis of changes induced by nonylphenol in Sprague-Dawley rat Sertoli cells〔J〕.Chem Res Toxicol，2009；22(4)：668-75.

7祝皓.痹腫消湯及其有效成分阿魏酸干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究〔D〕.長沙：中南大學(xué)，2014.

8Wood ZA，Schroder E，Robin HJ，etal.Structure，mechanism and regulation of peroxiredoxins〔J〕.Trends Biochem Sci，2003；28(1)：32-40.

9朱芳玉.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗CCP抗體與氧化和抗氧化活性的相關(guān)性研究〔J〕.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012;(21)：2576-7.

10Kim CW，Cho EH，Lee YJ，etal.Disease-specific proteins from rheumatoid arthritis patients〔J〕.J Korean Med Sci，2006；21(3)：478-84.

11Baylor SM，Hollingworth S.Intracellular calcium movements during excitation-contraction coupling in mammalian slow-twitch and fast-twitch muscle fibers〔J〕.J Gen Physiol，2012；139(4)：261-72.

12董貝貝，朱芳蕓，魏海東，等.血紅素結(jié)合蛋白生化物性及應(yīng)用研究進展〔J〕.中國實驗血液學(xué)雜志，2013；21(2)：513-6.

13Trickey WR，Vail TP，Guilak F.The role of the cytoskeleton in the viscoelastic properties of human articular chondrocytes〔J〕.J Orthop Res，2004；22(1)：131-9.

14Venteclef N，Jakobsson T，Steffensen KR，etal.Metabolic nuclear receptor signaling and the inflammatory acute phase response〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2011；22(8)：333-43.

〔2015-03-17修回〕

(編輯徐杰)